Métodos Rápidos de Análisis de Leche mediante Instrumentos Infrarrojos Bienvenidos FOSS S.A. rrodriguez@foss.dk

Teoría NIR MilkoScan 4000 -CombiFoss 5000

Descubrimiento de NIR por William Herschel en abril de 1800 Ref. J. Near Infrared Spectrosc. 8, 75-86. 2000. March 17 1800 William Herschel completed his article, which describes the famous experiment that stated ”that there are rays coming from the sun, which are less refrangible than any of those that affect the sight. They are invested with a high power of heating bodies, but with none of illuminating objects; and this explains the reasons why they have hitherto escaped unnoticed” The paper was published at a meeting of the Royal Society in London on 24 April 1800 and later published in the Philosophical Transactions of the Royal Society. The experiment is accepted as the discovery of the NIR. Ref. J. Near Infrared Spectrosc. 8, 75-86. 2000. MilkoScan 4000 -CombiFoss 5000

¿ Por qué Infrarrojo Cercano ? Poca o ninguna preparación de muestra. No destructivo No se utilizan reactivos Operación simple Rápido menos de un minuto para parámetros múltiples Confiable Preciso MilkoScan 4000 -CombiFoss 5000

Espectroscopía Infrarroja El espectro Infrarrojo Cercano (NIR) se encuentra justo sobre la región visible del espectro electromagnético 800 to 2500 m Incrementa Frecuencia 200nm 380nm 800nm 2500nm 25,000nm Ray-X UV Visible NIR MIR FIR, Microondas Incrementa Longitud de Onda 50,000 cm-1 12,500 cm-1 4,000 cm-1 400 cm-1 Frequencia = 1 / longitud de onda MilkoScan 4000 -CombiFoss 5000

Efectos de la Energía Electromágnética en las Moléculas Microondas Rotación de moléculas IR Vibraciones Moleculares Fundamentales NIR Sobretonos y combinaciones de IR UV / Visible Transiciones electrónicas, energía de los electrones llevada a un estado de excitación X-Ray Transiciones a nivel del núcleo del átomo MilkoScan 4000 -CombiFoss 5000

Vibraciones Moleculares Cuando la Energía Electromagnética encuentra una substancia, la misma será absorbida o transmitida dependiendo de su frecuencia y la estructrura molecular de la substancia. Las moléculas vibran naturalmente. Estiramiento Estiramiento Simétrico Estiramiento asimétrico Flexión MilkoScan 4000 -CombiFoss 5000

Vibraciones Moleculares  Cuando existe una coincidencia entre la frecuencia de la energía excitante y la frecuencia de vibración natural de la molécula, entonces esta molécula absorbe esta energía. MilkoScan 4000 -CombiFoss 5000

Vibraciones Moleculares Coincidencia entre la vibración natural y la vibración de la energía exitante. La energía es absorbida, se incrementa la amplitud de vibración de la molécula = un pico de absorbancia No hay coincidencia No hay absorbancia No hay pico MilkoScan 4000 -CombiFoss 5000

Ejemplo de Absorbancia MilkoScan 4000 -CombiFoss 5000

Absorbancia Molecular What is absorbance? The relative positions of atoms in a molecule are not exactly fixed but instead fluctuate continuously as a consequence of different type of vibrations. If the frequency of the NIR radiation matches the natural vibrational frequency of the molecule , there occurs a net transfer of energy that results in a change of the amplitude of the molecular rotation which results in absorption of the NIR radiation. MilkoScan 4000 -CombiFoss 5000

Ley de Lambert Beer P0 P T = -log10T = A = P P0 log A = a b c b P P0 Solución absorbente de concentración ”c” Absorbancia -log10T = A = P P0 log A = a b c P Parallel Radiation C Concentration in solution of absorbing species [g L-1] b Thickness of solution (37um), Path length T Transmittance, Incident radiation transmitted by solution a Proportionality constant, Absorptivity [L g-1cm-1] Concentración MilkoScan 4000 -CombiFoss 5000

- CH - OH - NH Bandas de Absorción Grasa Humedad Proteína Las bandas de absorción observadas en la región del Infrarrojo Cercano (NIR), provienen principalmente de vibraciones de moléculas con enlaces de átomos de hidrógeno. H - C - O - C - R H O O Grasa - CH - OH - NH Grasa Humedad Proteína H O N-CH-C CH3 Proteína MilkoScan 4000 -CombiFoss 5000

Absorción Molecular Alcoholes C O 9.5 m Lactosa Amidos Aminoácido H2C OH H2C OH O O HO H OH H H Alcoholes O OH OH C O H H H H H 9.5 m H OH H OH Lactosa COOH R2 O H O = = H2N C H C CH N C HC N C N = CH N - H 6.5 m Amidos R R1 H O R3 H Aminoácido Proteína MilkoScan 4000 -CombiFoss 5000

Absorción Molecular Grasa A Grasa B Grasa B 5.7 m C = O Grasa A C H HC H2C = O C H R2 R1 Grasa A R3 Grasa B CH3(CH2)7CH=CH(CH2)7COOH CH3CH2CH2COOH Ácido butírico Ácido oleico CH3(CH2)14COOH Ácido palmítico CH2-OH Glicerol + CH-OH Grasa B 5.7 m C = O Grasa A C H 3.5 m MilkoScan 4000 -CombiFoss 5000

Tecnología IR Descomposición de la luz MilkoScan 4000 -CombiFoss 5000

Transmitancia / Reflectancia Fuente de energía Detector Detector Fuente de energía This picture illustrates the difference between transmittance and reflectance. It is important to point out that with transmittance in the NIR range, it is possible to penetrate up to 30 mm of the sample (especial in the low nm range) and the entire path length of the sample is integrated into the spectral measurement. With reflectance only 0.1-1 mm of the surface will be penetrated which will create problems for non-homogenous samples. ITEC169A ITEC168A Transmitancia (NIT) Reflectancia (NIR) MilkoScan 4000 -CombiFoss 5000

Transflectancia Reflector Detector Fuente de Energía This picture illustrates the transflectance. Transflectance is a combination of transmittance and reflectance. Detector MilkoScan 4000 -CombiFoss 5000

Espectro completo Infrarojo de la leche Carb. TS Carb. ref Ci Urea P Fat A Fat A ref Fat B Fat B ref P ref Homog. MilkoScan 4000 -CombiFoss 5000

Monocromador MilkoScan 4000 -CombiFoss 5000

Interferómetro MilkoScan 4000 -CombiFoss 5000

Instrumento de filtros Sistema Óptico Rueda de filtros Sensor Infrarojo Fuente Infraroja Cubeta Espejo MilkoScan 4000 -CombiFoss 5000 1 1 1 1

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MilkoScan S50B Sistema de Flujo MilkoScan 4000 -CombiFoss 5000

MilkoScan Tecnología IR Fuente IR Filtro óptico Cubeta Detector Procesador Los enlaces moleculares absorben energía en longitudes de onda específicas. En este caso, tenemos 4 filtros IR que proveen esas longitudes de onda específicas 3.5  (Grasa B),correspondiente a vibraciones en el enlace C-H de las moléculas de GRASA 6.5 , correspondiente a las vibraciones en los enlaces péptidos en las moléculas de PROTEINA 9.5 , correspondiente a vibraciones en los enlaces hidroxilos en las moléculas de lactosa Longitud de onda de refencia, donde no hay absorbancia de ningún componente Blackbody radiation from a glowing metal spiral at 800-900 C Optical interference filter provide relatively narrow bands of radiation. Radiation of particular wavelength are reinforced between semitranparent metallic films, while most other wavelength, being out of phase, suffer from destructive interference. 37 um pathlength between CaF2 windows Pyroelectric detector MilkoScan 4000 -CombiFoss 5000

Linearidad - Cubeta Pagua A = log Pleche E A = a b c T0 = Er T0 P Absorbancia E A = a b c T0 = Er Concentración T0 P Función lineal A = log Ts= Ts Pr E . Pr - O CH = -S ln Er P + I 1 - O S = Pendiente I = Ordenada Ch = Datos de la longitud de onda O = Desplazamiento MilkoScan 4000 -CombiFoss 5000

Datos cubeta Material: Paso óptico Fluoruro de Calcio Zafiro Paso óptico 30 a 50 micrones Para analizar más de 100 muestras por hora, normalmente se precisa un acumulador (o hacer más ancho el paso óptico) para evitar deformaciones momentáneas de los cristales por la presión de la bomba Los vidrios no se montan paralelos para que la reflectancia de la cubeta sea igual a la de la leche y evitar errores de medición MilkoScan 4000 -CombiFoss 5000

Homogeneizador El concepto es que los glóbulos grasos tengan todos el mismo tamaño para no interferir en la medición. Normalmente se busca que el diámetro del glóbulo graso no sea mayor a 1/3 de la longitud de onda mínima que se utiliza en la medición (en la práctica para leche: 1 micrón) La presión normalmente utilizada para esto es 200 bares, aprox. 205 kg / cm2 Se hace siempre a 40°C MilkoScan 4000 -CombiFoss 5000

Datos fuente y detector IR Fuente IR: trabaja a una temperatura de 1150 °K Detector IR: termocupla MilkoScan 4000 -CombiFoss 5000

Factores que afectan la medición Temperatura: debe ser estable +/- 0,10°C Aire libre en la muestra: mantener la presión estable en la cubeta Humedad en la caja infraroja Vibraciones (especialmente en los equipos FTIR) MilkoScan 4000 -CombiFoss 5000

Tecnología FTIR Descomposición de la luz MilkoScan 4000 -CombiFoss 5000

Espectro completo vs. Instrumentos de filtros Carb. TS Carb. ref Ci Urea P Fat A Fat A ref Fat B Fat B ref P ref Homog. MilkoScan 4000 -CombiFoss 5000

Monocromador MilkoScan 4000 -CombiFoss 5000

Red holográfica Líneas finas producidas con un Laser (400/mm) separan la luz blanca en todas las longitudes de onda que la componen. MilkoScan 4000 -CombiFoss 5000

Interferómetro MilkoScan 4000 -CombiFoss 5000

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Algunas diferencias de parámetros entre Filtros y FTIR MilkoScan 4000 -CombiFoss 5000 2 2 2 2

Configuración Maestro y Esclavo Laboratorio central Maestro Fábrica A Fábrica C Esclavo 1 Esclavo 2 Fábrica B Fábrica D Esclavo 3 Esclavo 4 MilkoScan 4000 -CombiFoss 5000

Estandarización: Instrumento Maestro MilkoScan 4000 -CombiFoss 5000

Estandarización: Instrumento Esclavo MilkoScan 4000 -CombiFoss 5000

Maestro y Esclavo no coinciden MilkoScan 4000 -CombiFoss 5000

Haciendo coincidir las longitudes de onda MilkoScan 4000 -CombiFoss 5000

Haciendo coincidir las longitudes de onda MilkoScan 4000 -CombiFoss 5000

Coincidencia de longitudes de onda MilkoScan 4000 -CombiFoss 5000

Haciendo coincidir las absorbancias MilkoScan 4000 -CombiFoss 5000

Haciendo coincidir las absorbancias MilkoScan 4000 -CombiFoss 5000

Coincidencia Perfecta MilkoScan 4000 -CombiFoss 5000

Principio de Calibración Calibración Básica Viene de fábrica, no se modifica normalmente “Tradicional”: Linearización - Intercorrecc - Ganancia “MLR”: Linearización - MLR matrix - Ganancia PLS: (“Modelo PLS” - Const & Coef. B Pendiente y Ordenada (Slope & Bias) Calibración in situ Responsabilidad del cliente IR Conductividad MilkoScan 4000 -CombiFoss 5000

Calibración Básica CX = S (F1 Chlac + F2Chpro + F3Chgra) + B Calibración básica realizada en fábrica H2C OH OH HO H O Lactosa HC O = C H R3 FAT B FAT A CX = S (F1 Chlac + F2Chpro + F3Chgra) + B N H CH C R2 = O HC R1 Proteína Ch = Datos del canal X CX = Concentración del componente X S = Pendiente B = Ordenada al origen MilkoScan 4000 -CombiFoss 5000

Ejemplo de Calibración de Pendiente y Ordenada MilkoScan 4000 -CombiFoss 5000

Parámetros Derivados IR S/I Grasa(b) Proteína Lactosa Grasa (a) + Sólidos Grasa A/B Derivados (2) Derivados (1) Calibraciones Calibraciones Básicas Pend. y Ordenada MilkoScan 4000 -CombiFoss 5000