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Propiedades de los ácidos nucleicos Métodos de análisis Tema 3. Propiedades de los ácidos nucleicos Métodos de análisis gel de electroforesis (marcaje fluorescente por EtBr)

contenido • Propiedades químicas: vistas en estructura (tema 2) • Propiedades físicas: - absorción luz UV - desnaturalización - reasociación - viscosidad • Caracterización: - efecto hipercrómico - curvas Cot - secuenciación (tema 29) • Aislamiento y caracterización: - centrifugación - electroforesis • Detección: - marcaje radiactivo - hibridación: tipos, FISH, chip, Southern - amplificación (PCR - tema 29)

contenido • Propiedades químicas: vistas en estructura (tema 2) • Propiedades físicas: - absorción luz UV - desnaturalización - reasociación - viscosidad • Caracterización: - efecto hipercrómico - curvas Cot - secuenciación (tema 29) • Aislamiento y caracterización: - centrifugación - electroforesis • Detección: - marcaje radiactivo - hibridación: tipos, FISH, chip, Southern - amplificación (PCR - tema 29)

Absorción de luz ultravioleta (UV) Figure 10-7 the absorption spectrum (which shows the range of wavelength where nucleic acids and proteins absorb UV light).

desnaturalización y reasociación desnaturalización y reasociación (o renaturalización) del DNA Reasociación: - basada en la complementariedad - efecto cremallera desde 7-8 pb

Viscosidad del DNA en solución disminuye al fragmentarse: agitación mecánica, sonicación (ultrasonido) desnaturalizarse: calor, baja fuerza iónica, pH alcalino, urea, …

contenido • Propiedades químicas: vistas en estructura (tema 2) • Propiedades físicas: - absorción luz UV - desnaturalización - reasociación - viscosidad • Caracterización: - efecto hipercrómico - curvas Cot - secuenciación (tema 29) • Aislamiento y caracterización: - centrifugación - electroforesis • Detección: - marcaje radiactivo - hibridación: tipos, FISH, chip, Southern - amplificación (PCR - tema 29)

efecto hipercrómico Figure 10-20 Increase in UV absorption vs. temperature (the hyperchromic effect) for two DNA molecules with different GC contents. The molecule with a melting point of 83° C has a greater GC content than the molecule with a of 77° C.

efecto hipercrómico por desnaturalización del DNA reaccion de desnaturalización Aumenta la OD aprox 30-40% máximo, al calentar (desnaturalizar) un DNA 2c (doble cadena) Desnaturalización puede deberse a aumento de temperatura (aprox. 100ºC) o pH (pH: 12, completamente desnaturalizado)

efecto hipercrómico

absorción de UV por los ácidos nucleicos también nt aislados absorben mas UV que polimerizados

efecto hipercrómico Figure 10-20 Increase in UV absorption vs. temperature (the hyperchromic effect) for two DNA molecules with different GC contents. The molecule with a melting point of 83° C has a greater GC content than the molecule with a of 77° C.

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desnaturalización y reasociación desnaturalización y reasociación del DNA Tasa de reasciación: depende de la concentración de las cadenas nucleotídicas y de su composición de bases (C+G/A+T)

cinética de reasociación Figure 10-23. Copyright © 2006 Pearson Prentice Hall, Inc The ideal time course for reassociation of DNA when, at time zero, all DNA consists of unique fragments of single-stranded complements. Note that the abscissa (C0t) is plotted logarithmically. Estudiada y refinada por Britten y Kohne: no todo el DNA codifica proteínas!

Curvas Cot Figure 10-24 Copyright © 2006 Pearson Prentice Hall, Inc The reassociation rates of DNA derived from phage MS2, phage T4, and E. coli. The genome of T4 is larger than MS2 and that of E. coli is larger than T4.

Curvas Cot de procariotas: estimación de la complejidad de los genomas

Figure 10-25 Copyright © 2006 Pearson Prentice Hall, Inc Comparison of and genome size for phage T4, E. coli, calf, and salamander.

1/2 = 1/(1 + k Cot ) Cot1/2 = 1/k X = a Cot a standart: 5 X 10E5 R. Número de repeticiones de una secuencia f: porcentaje en el que se encuentra esa secuencia en la mezcla N: longitud total del genoma X: longitud del fragmento (complejidad) X = a Cot 1/2

Figure 10-26 Copyright © 2006 Pearson Prentice Hall, Inc The curve of calf thymus DNA compared with E. coli. The repetitive fraction of calf DNA reassociates more quickly than that of E. coli, while the more complex unique calf DNA takes longer to reassociate than that of E. coli.

Curvas Cot de eucariotas: tres tipos de DNA

Cot1/2 puro = f Cot1/2 mezcla 1/2 = 1/(1 + k Cot ) 1/2 Cot1/2 puro = f Cot1/2 mezcla a standart: 5 X 10E5 Cot1/2 puro = f Cot1/2 mezcla R. Número de repeticiones de una secuencia f: porcentaje en el que se encuentra esa secuencia en la mezcla N: longitud total del genoma X: longitud del fragmento (complejidad) X R = f N X = a Cot 1/2

Calf: ternera; toad: sapo; sea urchin: erizo de mar

genoma nuclear humano Figura 7.10 Genomes 3 (© Garland Science 2007)

no todo el DNA codifica proteínas Britten y Kohne, 60’s

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centrifugación rotores y centrífugas centrífugas y rotores

centrifugación diferencial

centrifugación zonal gradiente de sacarosa separación por tamaño Separación por tamaño ( = velocidad de sedimentación) separación por tamaño

centrifugación isopícnica gradiente de CsCl centrifugación isopícnica: gradiente de densidad de sal pesada (CsCl o CsSulfato) Separación por densidad ( = equilibrio de sedimentación) separación por densidad

Figure 10-18 Separation of a mixture of two types of nucleic acid by gradient centrifugation. To fractionate the gradient, successive samples are eluted from the bottom of the tube. Each is measured for absorbance of ultraviolet light at 260 nm, producing a profile of the sample in graphic form.

tubo de gradiente de CsCl y ultracentrífuga

Figure 10-19 Percentage of guanine–cytosine base pairs in DNA, plotted against buoyant density for a variety of microorganisms.

Varía desde el 19% al 73%!

Separación DNA2c y DNAss 1. centrifugación isopícnica 2. tratamiento con nucleasas específicas de DNA2c o DNAss 3. columnas de hidroxiapatito: retienen DNA2c y pasa el DNAss (el DNA2c puede ser eluido aumentando la temperatura o la concentración salina) 4: filtros de nitrocelulosa: unen DNAss y no DNA2c Hidroxiapatito: forma cristalina del fosfato calcico

electroforesis Instrumental de electroforesis

electroforesis Figure 10-27 Electrophoretic separation of a mixture of DNA fragments that vary in length. The photograph shows an agarose gel with DNA bands corresponding to the diagram. gel: agarosa o poliacrilamida (moleculas más pequeñas)

gel de electroforesis (marcaje fluorescente por EtBr)

gel de electroforesis (marcaje fluorescente por EtBr)

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radio marcaje radiactivo Radioisotopos: espectrofotometría de centelleo líquido (fósforo+radioactividad -> emite luz -PMT-) o autorradiografía (reducción de la plata de una película fotográfica) Beta: electrones; gamma: rayos electromagneticos (; alfa: 2 protones + 2 neutrones) Ademas de radioisótopos, están los isótopos pesados (que son estables). Los más usados en biologia: N14->N15; C12->C13 Otras señales: fluorescencia, luminiscencia, quimioluminiscencia… La biotina es una molécula que se une con alta afinidad a la avidina y a otras proteínas relacionadas, como la streptavidina. Esta afinidad se ha utilizado para un gran número de aplicaciones en el campo de la biotecnología. Por ejemplo, el complejo avidina-biotina se ha utilizado como sistema de detección de biomoléculas (proteínas, carbohidratos, DNA, lípidos, fármacos, etc.): la molécula diana se combina con la biotina de manera que esa molécula biotinilada se detecta y separa de la solución fácilmente. La gran ventaja consiste en que la biotinilización de la molécula diana puede llevarse a cabo sin cambiar sus propiedades biológicas o físico-químicas y sin afectar a la capacidad de unión de la biotina a la avidina. En el mismo sentido, la afinidad biotina-streptavidina es una de las más utilizadas en ensayos moleculares, inmunológicos y celulares. La streptavidina puede detectarse y cuantificarse con un alto grado de sensibilidad en el complejo formado, por ejemplo, marcándola con una enzima o un marcador fluorescente o radiactivo.

autorradiografía de una electroforesis

isótopos pesados - isótopos más usados en biología: N14 y N15; C12 y C13; H y D - uso en centrifugación isopícnica Isótopos estables (no se desintegran emitiendo radioactividad) D: deuterio o H pesado (=H2)

desnaturalización y reasociación desnaturalización y reasociación (o renaturalización) del DNA Reasociación: - basada en la complementariedad - efecto cremallera desde 7-8 pb

hibridación molecular Figure 10-21 Diagrammatic representation of the process of molecular hybridization between DNA fragments and RNA that has been transcribed on one of the single-stranded fragments. hibridación molecular

hibridación DNA/RNA Hibridación molecular

hibridación en filtro Hibridación en filtro

hibridación en colonia

FISH FISH: base de la técnica

FISH: cromosomas X e Y

FISH centrómeros telómeros Figure: 10-15 In situ Hybridization of Human Metaphase Chromosomes In situ hybridization of human metaphase chromosomes, using a fluorescent technique (FISH). The probe, specific to centromeric DNA, produces a yellow fluorescence signal indicating hybridization. The red fluorescence is produced by propidium iodide counterstaining of chromosomal DNA.

cariotipo espectral humano

chips de DNA Chips de DNA: la técnica

microarrays

un chip de DNA y la imagen fluorescente

Southern electroforesis + transferencia + hibridación = electroforesis pocillos con DNA electroforesis esponja solución salina gel filtro la solución sube a través del gel al filtro y a la pila de papeles absorbentes DNA en el filtro la sonda hibrida con las secuencias complementarias hibridación con una sonda el filtro se expone a una película o una placa sensibles transferencia electroforesis + transferencia + hibridación = Blot (verbo): secar una superficie húmeda mediante un material absorbente

electroforesis hibridación Electroforesis (izquierda) y autorradiografia de la hibración (derecha) electroforesis hibridación

Southern (DNA) Northern (RNA) Western (proteínas) Southern y también Northern (RNA) y Western (proteína)

problemas capítulo 1 2ª ed.: 14-24 (el 23 no) 3ª ed.: 14-23 1 h de clase: 6-noviembre-2009

Laboratorio virtual en http://learn.genetics.utah.edu/ Aislar DNA, PCR, chip DNA y electroforesis y mas…. http://learn.genetics.utah.edu/content/labs/gel/

papelera 67

genoma humano satélite minisatélite microsatélite SINEs LINEs transposones

Electroforesis de DNA: base de la técnica

Estudios con DNA hipercromicidad reasociación Análisis hibridación PCR Detección centrifugación electroforesis Aislamiento

cebador directo inverso PCR PCR

Southern electroforesis + transferencia + hibridación Southern: combina electroferesis e hibridación

transferencia para Southern

Southern electroforesis + transferencia + hibridación Southern: combina electroferesis e hibridación

Southern: electroforesis de DNA y autorradiografía (hibridación)

Southern Northern Western