Medición De Productos De Microorganismos Microbiología De Alimentos Gabriela Sarahi Rodriguez Aranda

INTRODUCCIÓN Células microbianas propiamente dichas Los productos de interés comercial producidos por los microorganismos se encuadran en cuatro categorías: Células microbianas propiamente dichas Macromoléculas que sintetizan ( por ejemplo enzimas) Productos de su metabolismo primario que son compuestos esenciales para su desarrollo, como muchos aminoácidos o vitaminas. Los productos de su metabolismo secundario, que son compuestos no esenciales para su desarrollo, como fenoles, alcoholes, ácidos orgánicos, etc.

Metabolito: es una molécula utilizada y/o producida durante el metabolismo

Primario: producido en la fase primaria de crecimiento del metabolismo Primario: producido en la fase primaria de crecimiento del metabolismo. Moléculas de bajo peso molecular que intervienen, bien como productos finales o intermediarios, en las distintas rutas anabólicas y catabólicas. Secundario: producido al final de la fase primaria de crecimiento y comienzo de la fase estacionaria. Generalmente a partir de productos productos intermedios acumulados sea en el medio de cultivo o en las células, durante el metabolismo primario. Estos tipos de metabolismo se ven relacionados porque los productos del primario son los sustratos del secundario. Metabolitos primarios 1) Son necesarios para el crecimiento del microorganismo que los produce. 2) Se producen como productos únicos 3) Son producidos por todos los microorganismos (son universales). Metabolitos secundarios Se producen cuando la velocidad de crecimiento es baja, no tienen pues una función esencial en el crecimiento.

CUANTIFICACIÓN DE METABOLITOS TÉCNICA MICROORGANISMO Peróxidos Titulación Ácido acético Acetaldehído Indol Cromatografía líquida de alta eficacia Riboflavina (B2) Ashbya gossypii Lisina Brevibacterium flavium Sorbosa Ácido glucónico Nefelometría Glicerol Espectroscopia de masas Cobalamina (B12) Electroforesis Propionibacterium Pseudomonas dinitrificans

METABOLITO TÉCNICA MICROORGANISMO Espectrofotometría Fenoles Titulación Ácido glutámico Corynebacterium glutamicum Ácido láctico Lactobacillus Etanol Ebulloscopía Saccharomyces cerevisiae Indol Fluorimetría Cromatografía en capa fina Aminas Ácido succínico Ácido fumárico Ácido cítrico Aspergillus niger Glicerol Cromatografía de gases

METABOLITO TÉCNICA MICROORGANISMO Toxinas: Cromatografía líquida de alta eficacia Aflatoxinas Aspergillus flavus Fumonisina B1 Fusarium Enzimas: Método de Tatini Desoxirribonucleasa termoestable Staphylococcus aureus

Técnicas para la medición de los productos derivados de microorganismos Titulación Cromatografía Líquida de Alta eficacia Nefelometría Espectroscopia de masas Electroforesis Espectrofotometría Titulación Ebulloscopia Fluorimetría Cromatografía de capa fina Cromatografía de gases Método de Tatini

TITULACIÓN El análisis volumétrico es una técnica basadas en mediciones de volumen para calcular la cantidad de una sustancia en solución, y consiste en una valoración (titulación), que es el proceso de determinación del volumen necesario de solución (solución patrón) que reacciona con una masa o volumen determinado de una muestra. La adición de solución patrón se continúa hasta alcanzar el punto llamado punto final, momento cuando el número de equivalentes de una sustancia es igual al número equivalentes de la otra

Titulación Productos cuantificables: Sabor avinagrado Olores desagradables Antioxidante Peróxidos Aminoácido esencial Ácido acético Sabor en fermentación láctica Acetaldehído Fenoles Ácido glutámico Ácido Láctico Aminas Ácido cítrico Rancidez alimentos altos en grasas Peróxidos: Provocan enranciamiento de alimentos con alto contenido en grasas o aceites adquiriendo un sabor desagradable. Produce degradación de color en productos cárnicos. Ácido acético: Sabor a vinagre. Componente fundamental para el aroma de vino. Acetaldehído: Le otorga al vino un olor desagradable

Cromatografía Líquida de Alta eficacia HPLC La cromatografía es un método físico de separación basado en la distribución de los componentes de una mezcla entre dos fases inmiscibles, una fija o estacionaria y otra móvil. En la cromatografía líquida, la fase móvil es un líquido que fluye a través de una columna que contiene a la fase fija.

Cromatografía Líquida de Alta eficacia Productos: Indol Riboflavina Lisina Sorbosa Aflatoxinas Fumonisina Indol : Proviene de triptófano, aromatizante y precursor del pigmentos. Riboflavina B2: Vitamina del complejo B, benéfica para la piel y la vista. Lisina: Aminoacido esencial. Sorbosa: Utilizada en producción comercial de vitamina C Aflatoxinas: Se desarrolla en granos almacenados, efectos tóxicos inmediatos. Fumonicina: Tóxica, inhibe metabolismos de lípidos.

Nefelometría Se define como la detección de la energía lumínica dispersa o reflejada hacia un detector que no se encuentra en el camino directo del haz luminoso. A mayor tamaño de las partículas, más cantidad de luz incidente sufrirá dispersión a partir de su dirección inicial. Existe una dependencia angular de la intensidad de luz dispersa, y la distribución angular resultante que sufre dicha luz, indica el tamaño y la forma de las partículas dispersas. La formación de inmunocomplejos se ha relacionado con la cuantía de dicha dispersión y se ha empleado como fundamento para cuantificar antígenos.

Nefelometría Ácido glucónico (pentahidroxicaproico) Es el producto de oxidación de la D-glucosa en el C1 Se utiliza como acidulante para alimentos. Usado universalmente como un ácido latente en polvos para hornear, sustancias leudantes para panificación.

Espectroscopia de masas La espectrometría de masas es una técnica analítica de gran potencial que nos permite elucidar estructuras químicas. La técnica se  basa en la medición de la relación masa/carga de especies moleculares. Las determinaciones requieren de la generación de especies cargadas eléctricamente, lo cual se logra  por diferentes metodologías como pueden ser el impacto electrónico, el bombardeo de átomos rápidos y la generación de iones enlazados. La medición de la relación masa/carga nos permite también saber el peso molecular exacto de la molécula.

Espectroscopia de masas Glicerol Subproducto en la fermentación alcohólica Indicador de adulteración

Electroforesis La electroforesis es una técnica para la separación de moléculas según la movilidad de estas en un campo eléctrico a través de una matriz porosa, la cual finalmente las separa por tamaños moleculares y carga eléctrica, dependiendo de la técnica que se use. Ejemplos microorganismos: Lactobacillus, Propionibacterium, Pseudomonas

Espectrofotometría Se refiere a la medida de cantidades relativas de luz absorbida por una muestra, en función de la longitud de onda. Cada componente de la solución tiene su patrón de absorción de luz característico. Comparando la longitud de onda y la intensidad del máximo de absorción de luz de una muestra versus soluciones standard, es posible determinar la identidad y la concentración de componentes disueltos en la muestra (solución incógnita). Este aparato es de uso habitual en cualquier laboratorio de Microbiología o Bioquímica. Mide la densidad óptica (D.O.), es decir la absorbancia (una medida de la luz transmitida a través de la supensión). Por supuesto, hay que realizar una curva estándar para relacionar los valores de A con la masa bacteriana en una muestra problema. Comentarios: La cantidad de luz dispersada es proporcional al cociente entre el tamaño de la partícula y la longitud de onda incidente; la sensibilidad de la técnica aumenta pues a longitudes de onda (l) cortas. La proporcionalidad entre A y masa bacteriana sólo es válida para >107céls/ml.

Ebulloscopia Etanol (Alcohol Etílico): La ebulloscopia es la determinación del punto de ebullición de un líquido en el que se halla disuelta una sustancia, lo que permite conocer el grado de concentración de la solución. El soluto que se encuentra en un líquido disminuye su presión de vapor, lo que se traduce en un incremento del punto de ebullición. Etanol (Alcohol Etílico): Presente en bebidas alcohólicas, medicamentos y cosméticos, buen disolvente, anticongelante, combustible y desinfectante.

Fluorimetría La espectroscopia de fluorescencia es un tipo de espectroscopia electromagnética que analiza la fluorescencia a partir de una muestra. La espectroscopia de fluorescencia utiliza un rayo de luz, normalmente ultravioleta, que excita a los electrones de las moléculas de ciertos compuestos y hace que emitan luz.

Cromatografía de capa fina Se basa en la preparación de una capa, uniforme, de un absorbente mantenido sobre una placa. La fase estacionaria será un componente polar y el eluyente será por lo general menos polar que la fase estacionaria, de forma que los componentes que se desplacen con mayor velocidad serán los menos polares. Identificación Y Aislamiento De Péptidos Y Aminoácidos, Así Como Metabolitos Primarios. Ejemplos microorganismos: Streptomyces sp. , Bacillus sp., Aspergillus niger. Se utiliza una placa de cromatográfica inmersa verticalmente en un solvente apolar. La placa de cromatografía consiste en una fase estacionaria polar (sílica gel) adherida a una superficie solida con algún agente cementante. Identificación por cambio de color de la placa de cromatografía y ascendencia por capilaridad.

Cromatografía de capa fina Aminas. Se oxidan con facilidad, cambian el color de los productos y forman compuestos de olor desagradable. Acido succínico. Acidulante y regulador de pH. Ácido fumárico. Aditivo que proporciona estabilidad. Ácido cítrico. Conservador y saborizante.

Cromatografía de gases La muestra se volatiliza y se inyecta en la cabeza de una columna cromatográfica. de gas inerte. La elución se produce por el flujo de una fase móvil El gas portador cumple básicamente dos propósitos: Transportar los componentes de la muestra, y crear una matriz adecuada para el detector. Identificación y cuantificación de etanol, ácidos orgánicos, sistemas bioquímicos. Ejemplos microorganismos: Pseudomonas sp., Saccharomyces sp., Zymomonas sp., y Lactobacillus sp. La muestra que se va a analizar se volatiza para después inyectarse en “la cabeza” de una columnade cromatografía. El gas inerte dentro de la columna cumple su función de mover la muestra volatizada alrededor de la columna para ser identificada y cuantificada. Es importante elegir el gas inerte por su pureza, costo, disponibilidad y adecuado para el detector que se utilizara.

Método de Tatini Indica de manera indirecta la presencia de grandes cantidades de Staphylococus aureus en los alimentos. Rosa =positivo 20 g de muestra + 40 mL de agua destilada (ajustar pH 3.8) Centrifugación  adicionar ácido tricloroacético en frío al centrifugado Centrifugar  disolver en tris-buffer-metil-aminometano y en 1 mL de Cl2Ca 0,1M (pH a 8,6) Ebullición por 15 min.  enfriado a 50°C Extracción a pocillos en agar-DNasa azul de toluidina Incubación 37°C x 24 hrs.

REFERENCIAS Jay J., Loessner M., Golden D. 2005. Modern Food Microbiology. 7ª edición. Editorial Food Science Text Series. U.S.A. J. Muntané Relat (2010) Introducción a la Investigación Básica. Liver Research Unit. Hospital Universitario Reina Sofía. Vol. 33 N° 3 http://www.sapd.es/revista/article.php?file=vol33_n3/03 fecha de consulta (19/09/2013)

Rev Cubana Aliment Nutr 2007;17(2):103-108 ARTÍCULO Elaboración De Una Bebida Fermentada A Partir Del Suero De Queso. Características Distintivas Y Control De Calidad Rev Cubana Aliment Nutr 2007;17(2):103-108 Instituto de Investigaciones Agropecuarias “Jorge Dimitrov”. Bayamo. Granma, Cuba. Oscar Miranda Miranda1, Pedro Luis Fonseca2, Isela Ponce3, Ciro Cedeño4, Lourdes Sam Rivero5, Libia Martí Vázquez6.

Introducción El suero es un subproducto resultante de la elaboración de quesos que se distingue por su elevado valor nutritivo. Sin embargo, grandes cantidades de este subproducto no se aprovechan adecuadamente, y muchas veces se vierten en los ríos aledaños a los centros productores, como parte de los efluentes fabriles. La alta demanda biológica de oxígeno de estos desechos, estimada entre 30 y 50 mil partes por millón (ppm), los convierte en graves focos de contaminación ambiental.

Introducción El suero se ha utilizado como uno de los ingredientes en la elaboración de bebidas fermentadas con una acidez final del 0.54%, y que han sido aceptadas por el consumidor. Los altos volúmenes de producción de suero de queso en Cuba, el contenido de vitaminas y minerales de este subproducto, el alto tenor de lactosa, el bajo costo de obtención, y el escaso aprovechamiento industrial, hacen posible su utilización como substrato para la elaboración de bebidas fermentadas.

Objetivo Presentar una bebida fermentada elaborada a partir del suero de queso, subproducto del Combinado Lácteo de Bayamo (Granma, Cuba), junto con las principales características sensoriales, físicas, químicas, microbiológicos.

Materiales Y Métodos Elaboración de la bebida. Se realizaron 5 corridas de 30 litros cada una a nivel de Planta Piloto (Combinado de Productos Lácteos de Bayamo). Se utilizó la tecnología de leche fermentada de coágulo, con inoculación a temperaturas de 43 – 45°C, y la adición ulterior de aromatizante y color.

Materiales Y Métodos Una vez inoculado, cada corrida se dispensó en potes plásticos de 500 mililitros de capacidad. Los potes se taparon y sellaron herméticamente, se incubaron durante 24 horas a la misma temperatura de inoculación. Terminado el período de incubación, los potes contentivos del producto fermentado se conservaron a 4 – 6ºC, en cámaras de temperatura controlada, otras 24 horas, antes de la realización de los ensayos.

Análisis físicos y químicos Materiales Y Métodos Análisis físicos y químicos Al final del proceso productivo, se seleccionaron muestras de cada corrida para determinar: acidez, pH, sólidos totales, contenido de lactosa, contenido de grasa, contenido de proteínas, y cenizas.

Materiales Y Métodos Titulación del contenido de ácido láctico Se determinó el contenido de ácido láctico en el producto inoculado a las 0, 2, 4, 6, 12, 18 y 24 horas. Se construyó la correspondiente curva de Acidez titulable (Y) vs. Tiempo de inoculación (X).

Materiales Y Métodos Análisis microbiológicos El conteo de microorganismos viables se realizó mediante los métodos de diluciones sucesivas del producto elaborado y siembra en placas de Petri. Se empleó el método MRS de cultivo. Se contaron los coliformes totales, los hongos filamentosos, y las levaduras.

Materiales Y Métodos Análisis sensoriales. La evaluación sensorial de la bebida elaborada se realizó mediante pruebas de aceptación – rechazo. Para ello, se emplearon 5 jueces entrenados en la degustación de productos lácteos fermentados. Cada uno de los jueces evaluó 3 muestras de 500 mililitros en cada muestreo programado. El juez determinó sobre el olor, sabor, aspecto, y textura del producto.

Materiales Y Métodos Finalmente, se realizó una prueba de aceptación masiva con la participación de 655 personas adultas, quienes dieron sus criterios acerca del producto según una escala efectiva de 7 puntos que recorre desde 1 (“Me gusta extremadamente”) hasta 7 (“Me disgusta extremadamente”).

Materiales Y Métodos Estabilidad del producto terminado. Se realizaron evaluaciones de las características físico- químicas y sensoriales del producto terminado diariamente, a partir de las 24 horas de concluido el proceso de elaboración. Se declaró que la calidad de la bebida no se correspondía con la propia del producto recién elaborado cuando las muestras ensayadas presentaron un sabor amargo, presencia de hongos, y desuere (esto es, separación de las fases líquida y sólida del producto) en su superficie.

Resultados La Figura muestra la dinámica de acidificación de la bebida inoculada con el cultivo lácteo. Como se observa, el contenido de ácido láctico en las muestras ensayadas se incrementó linealmente a partir de las 2 horas de inoculación. Los cultivos utilizados desarrollaron una mayor acidez a partir de las seis horas, lo que coincide con el aumento de la pendiente de la curva de titulación del ácido láctico, hasta llegar a ser de 0.71% a las 24 horas.

La composición físico-química del suero de queso y la bebida fermentada, respectivamente, aparecen en la Tabla 1. La concentración de ácido láctico en la bebida se incrementó en 7 veces respecto de los valores observados en el suero Por su parte, el pH decreció hasta 4.37, de un valor inicial de 6.30.

La evaluación de las características organolépticas de la bebida fermentada permitieron avalarla como un producto de sabor ligeramente ácido, agradable al paladar, con un coágulo viscoso, características todas que la hacen muy similar a un yogur aromatizado. La puntuación promedio otorgada por los jueces fue de 19.67, catalogada de “Muy Buena”.

Los estudios microbiológicos arrojaron un bajo número de coliformes totales, levaduras y hongos filamentoso en el producto terminado. Estos hallazgos permiten afirmar que la bebida fue realizada en condiciones higiénicas–sanitarias adecuadas, y que el número de organismos encontrados se encuentra dentro de las especificaciones de calidad microbiológica establecidas. En lo que respecta a la cantidad de cultivos viables en el producto final, se observaron 1.2x108 ufc/mL como promedio, valor comprendido dentro de las especificaciones de calidad para las bacterias ácido- lácticas durante el proceso de fermentación del yogur.

Discusión Los resultados mostrados en este trabajo demuestran que es factible la elaboración de una bebida fermentada teniendo como materia prima el suero de queso, subproducto del Combinado Lácteo de Bayamo que era desechado, al no existir hasta el momento una forma ulterior de aprovechamiento viable.

Discusión Se logró un incremento tiempo- dependiente de la acidez del producto fermentado. Ello demuestra que las bacterias ácido-lácticas inoculadas en el suero de queso durante el proceso de elaboración lograron crecer en este medio, gracias en parte a la composición de nutrientes de la materia prima inicial y el nivel de inóculo utilizado.

Discusión El decrecimiento del contenido de lactosa durante el proceso de elaboración de la bebida fermentada puede ser atribuible a la metabolización de este compuesto en ácido láctico, como consecuencia del crecimiento y la actividad de los cultivos lácticos. Se debe recordar que estos cultivos utilizan la lactosa. Resultados similares permiten explicar los cambios en las concentraciones de lactosa que ocurren durante la elaboración de yogur.

Discusión Finalmente, la mezcla empleada como materia prima para la elaboración de la bebida fermentada demostró ser apta para garantizar el crecimiento de las bacterias ácido- lácticas inoculadas. Es posible también que durante el proceso de incubación se haya producido una protocooperación entre el Lactobacillus acidophilus y el Streptoccocus thermophilus, para alcanzar una cantidad de cepas viables en el orden de las 108 ufc/mL.

Conclusión Los resultados encontrados después de evaluación de las características de la bebida fermentada presentada en este trabajo avalan un producto de buena calidad e inocuo, aceptado por los consumidores potenciales. Se obtuvo una acidez en el proceso de incubación y almacenamiento hasta las 24 horas de 0.70% (de ácido láctico). La duración de la bebida fermentada, envasada en potes de 500 mililitros, y almacenada a temperaturas de entre 4 y 6°C , fue de 7 días.