Precipitación y Concentración de DNA JA Cardé, PhD Biol 4019 - Lab Biología Celular Molecular Universidad de Puerto Rico-Aguadilla

Objetivos Precipitar ácidos nucleicos que se encuentran en solución. Utilizar correctamente un espectrofotómetro para medir absorbancia a largos de onda de 260 nm y 280 nm. Determinar concentración y pureza de ácidos nucleicos.

Introducción La técnica de precipitación etanólica tiene como fin: Remover residuos de cloroformo y/o fenol. Resuspender los ácidos nucleicos en pequeños volúmenes de agua destilada  o de TE pH 8.0 (Tris-HCL y EDTA) permitiendo así concentrarlos. El DNA se puede precipitar de solución acuosa, a temperaturas entre -20 ˚C y -70 ˚C, añadiendo una concentración moderada de cationes monovalentes (sales inorgánicas) y un volumen apropiado de etanol. El DNA se recobra a través de una centrifugación y se resuspende en un pequeño volumen de un amortiguador apropiado. Esta técnica es rápida y eficiente aun cuando se trabaja con cantidades pequeñas de DNA. 

Introducción … Luego de precipitar los ácidos nucleicos utilizando etanol, es necesario remover todos los residuos del mismo. La presencia de etanol en el DNA o RNA  interfiere con las reacciones enzimáticas y/o las electroforesis con geles de agarosa. Además, los residuos de etanol dificultan el proceso de resuspender los ácidos nucleicos en solución.     

Concentración y Pureza: Espectrofotómetro Son estimadas utilizando geles de agarosa, o el espectrofotómetro.   El espectrofotómetro es un instrumento que estima la cantidad de luz que es absorbida por la molécula en estudio (figura 1a). La muestra es colocada en una cuveta de cuarzo o plástico. El rayo de luz de un largo de onda particular pasa a través de la cuveta hasta un detector (fototubo).

Concentración y Pureza: Espectrofotometro El instrumento automáticamente refleja la lectura en absorbancia (o densidad óptica, OD). El OD puede ser calculado utilizando la siguiente fórmula: A = logIo/I Donde A = absorbancia, Io = intensidad de la luz entrando a la cuveta,   I = intensidad de la luz que alcanza al detector 

Absorbancia   Factores que podrían afectar la absorción de la luz de una solución: concentración, solvente utilizado, la distancia que viaja el rayo de luz la característica de la cubeta.     Para calcular la concentración de DNA o RNA en solución es necesario leer la absorbancia de una dilución a un largo de onda de 260 nm (OD260).  Además, es necesario conocer la siguiente información:  50 µg/ml de DNA de doble hebra refleja un O.D. de 1 a 260 nm 37 µg/ml de DNA de hebra sencilla refleja un O.D. de 1 a 260 nm 40 µg/ml de RNA de hebra sencilla refleja un O.D. de 1 a 260 nm

Concentración La ecuación para determinar la concentración del DNA es: Concentración de DNA (µg/ml) = (OD260) x (factor de dilución) x 50 µg de DNA/ml 1 Unidad de OD260 Ejemplo:  10 µl de DNA se obtienen de una muestra de DNA con un volumen total de 100 µl. Los 10 µl de DNA se añaden en la cuveta junto a 390 µl de agua. El OD260 obtenido es de 0.205.   Concentración de DNA (µg/ml) = (0.205) x (400) x 50 µg de DNA/ml  = 410 µg/ml 10       1 Unidad de OD260   Para estimar la concentración TOTAL de DNA en la muestra multiplique la concentración en µg/ml por el volumen de la muestra.       410 µg  x  0.09 ml* = 36.9 µg /ml  * Comenzamos con 100 µl de la muestra - 10 µl utilizados para la lectura de absorbancia = 90 µl; 90 µl / 1x106 ul/ml = Factor de dilucion – da una idea de cuan concentrado o diliuido esta una muestra Se calcula como volumen final / volumen inicial o vol total / volumen diluido Ej. Tomo 1 ul de A(muestra) y lo anado a 4 ul de B (diuyente) = 5/1: fd= 5 Tomo 2ul de A en 8 ul de B = 10/2 fd = 5 Tomo 5 ul de A y lo anado a 995 ul B: FD = 1000/5

Pureza: Abs260/Abs280 Además, es necesario estimar Abs a OD280. La razón entre la lecturas de OD260/ OD280 es utilizado para estimar la pureza de los ácidos nucleicos. Una preparación pura de DNA debe tener un radio OD260/ OD280 de 1.8 y el RNA un radio de 2.0. Un radio menor de 1.8 sugiere una extracción con fenol y cloroformo para remover las proteínas que contaminan la muestra de DNA. Y mayor de 1.8?    Ejemplo:  Si el OD260 de una muestra de DNA es de 0.205 y el OD280 es de 0.114, el radio OD260/ OD280 será de 1.8. ¡Un DNA puro!  

Materiales Agua Destilada Baño de Agua Cuvetas Plasticas Espectrofotómetro Etanol 70% Etanol 95% Microcentrífuga Micropipetas y puntas Papel Kimwips Vortex

Protocolo: Precipitación Etanólicas   1) Obtenga el microtubo que contiene el DNA con etanol al 95 %.  Centrifugue por 10 minutos a 12,000 rpm y descarte el sobrenadante. 2)  Añada 300 µl de etanol al 70 % frío y mezcle utilizando el vortex. 3)  Centrifugue por 5 minutos a 12,000 rpm y descarte el sobrenadante. 4) Invierta el microtubo con la tapa abierta sobre papel toalla. Déjelo reposar por 5 minutos. 5)  Incube el microtubo (tapa abierta) por 10 minutos a 65 ºC. Asegúrese de remover todo el etanol. 6)  Añada 50-200 µl de agua destilada previamente esterilizada. La cantidad de agua va a depender del precipitado presente en el microtubo. 7) Incube el microtubo (tapa cerrada) por 5-30 minutos en un baño de María a 65 ºC. Asegúrese de que el DNA se encuentra resuspendido completamente antes de proseguir.

Concentración y Pureza 1) Añada 1000 µl de agua destilada y previamente esterilizada a una cuveta plástica para espectrofotómetro. Este será su blanco.   2)  En otra cuveta de plástico, mezcle 10 µl de la solución de DNA (paso A-7) y 990 µl de agua destilada previamente esterilizada. 3)  Utilice el blanco para calibrar el espectrofotómetro. 4)  Coloque la cuveta plástica del paso B-2 en el espectrofotómetro y obtenga las lecturas de absorbancia a 260 nm y 280 nm. 5)  Estime la concentración y pureza del DNA de su muestra.  6)  Rotule correctamente su microtubo y guárdelo  a – 20 ºC hasta el próximo laboratorio.

Cálculos y Preguntas Preguntas   Utilizando las fórmulas aprendidas en este módulo, estime la concentración y pureza del DNA que se encuentra en solución. Preguntas  ¿Cual es el rol del etanol en la precipitación de los ácidos nucleicos? Explique su respuesta haciendo referencia a la estructura y enlaces de las macromoléculas. Si el radio OD260/ OD280  de su muestra es menor de 1.8, su muestra de DNA se encuentra contaminada con proteínas. ¿Qué ocurrió en el procedimiento que afectó los resultados? ¿Qué debe hacer para mejorar estos resultados? Como parte de su trabajo en un laboratorio, usted extrae DNA de un organismo dado. Luego de precipitar el DNA usted debe estimar la concentración del mismo. Cuando va a utilizar el espectrofotómetro se percata de que esta dañado. ¿Cómo usted puede estimar la concentración y pureza de su muestra de DNA? Explique el método utilizado y por qué lo utiliza. ¿Puede el DNA ser precipitado utilizando isopropanol? De poder ser utilizado, mencione las ventajas y desventajas que tiene el uso del mismo. 5El DNA puede ser resuspendido con agua destilada o TE. Mencione las ventajas y desventajas de utilizar agua destilada versus TE y lo contrario.