APOPTOSIS DE LAS CÉLULAS INFLAMATORIAS PERITONEALES EN UNA INFECCIÓN MURINA POR Taenia crassiceps: UNA CISTEIN PROTEASA DEL PARÀSITO INDUCE APOPTOSIS In vitro A LAS CÉLULAS T MURINAS. Zepeda, N. a, Solano, S. b, Copitin, N. a, Fernández, A. M. b, Hernández, L. c, Tato, P. b, González, M. a, Molinari, J.L. a*. a Departamento de Genética Molecular. Instituto de Fisiología Celular. Universidad Nacional Autónoma de México. México, D. F Ap. Postal Tel.: (5255) b Departamento de Microbiología y Parasitología. Facultad de Medicina. Universidad Nacional Autónoma de México. México. D. F Tel.: (5255) c Hematología, Hospital General. Secretaría de Salud. México, D. F Tel.: (5255) ext INTRODUCCIÓN. La infección por Taenia solium es una zoonosis parasitaria de gran importancia en el país. Es causante de la teniosis en su estadio adulto y de la cisticercosis en su estadio larvario. La elevada frecuencia de la cisticercosis y la neurocisticercosis y las graves consecuencias que ocasionan justifican la búsqueda de estrategias que permitan prevenirla. Se adoptó un modelo de cisticercosis experimental murina, causada por Taenia crassiceps., debido a que esta presenta grandes similitudes estructurales y antigénicas con la cisticercosis por T. solium. No se sabe bien acerca de las sustancias secretadas por Taeniides (Platelmintos) que afecten el sistema inmune del huésped. La cisteín proteasa en una enzima secretada por el parásito que participa en el proceso de invasión tisular así como también para hidrolizar inmunoglobulinas y degradan proteínas como la hemoglobina y colágena. Se ha encontrado apoptosis en células CD4+ inducida in vitro por una cisteín proteasa de Taenia solium. En este trabajo se caracterizaron estirpes celulares y se buscó apoptosis causada por la cistein proteasa que producen los metacestodos de T. crassiceps. HIPOTESIS. Si la cistein proteasa de T. solium induce a apoptosis en células CD4 in vitro, entonces la cistein proteasa de T. crassiceps debe inducir apoptosis en células inflamatorias peritoneales de ratón OBJETIVO. Caracterizar las estirpes celulares los primeros 16 días en una infección murina intraperitoneal causada por metacestodos de Taenia crassiceps y en ratones no infectados. Buscar apoptosis en las diferentes estirpes celulares. Buscar evidencias de que la cistein proteasa producida por los metacestodos de T. crassiceps es la que causa la apoptosis en las células de hospedero. METODOLOGÍA. Analizamos por citometría de flujo, las células inflamatorias peritoneales de ratones ♀ Balb/c infectados intraperitonalmente con metacestodos de T. crassiceps, marcadas con anticuerpos monoclonales fluorogénicos anti-ratón CD4+, CD8+, CD19+ y CD14+. La apoptosis fué estudiada con ensayos de Annexin A/PI y TUNEL. Hicimos co-cultivos de linfocitos de bazo de un ratón sano y metacestodos de T. crassiceps con el inhibidor de la cistein proteasa (E-64) tiñendo los linfocitos con anticuerpos monoclonales fluorogénicos anti-ratón CD4+ y CD8+, asi como también con TUNEL para detectar apoptosis. 1% A 1.5% D 7.3% B *4.3% C * 12.7 % E *6.5% F * TUNEL CD8CD8 CD4CD4 Fig. 3. Porcentaje de apoptosis de células CD4+ y CD8+ del bazo de un ratón sano (A y D); células CD4+ y CD8+ del bazo de un ratón sano en co-cultivo con metacestodos de T. crassiceps (B y E) y células en co-cultivo con metacestodos en presencia de E-64 (un inhibidor de la cistein porteasa) (C y F). *P> en los co-cutivos de células CD4+ y CD8+ con metacestodos –versus- células control o células CD4+ y CD8+ en co-cultivo con metacestodos en presencia de E- 64 –versus- células CD4+ y CD8+ en co-cultivo con metacestodos en ausencia de E-64. CONCLUSIONES. El número de macrófagos y monocitos se incrementa de manera significativa. El nùmero de linfocitos T y B dismimuyen. Se encontró apoptosis en células T CD4+ y eosinófilos. Los resultados sugieren que la apoptosis de las CD4 se debe a la presencia de una cistein proteasa secretada por el paràsito ya que in vitro esta proteasa se inhibió con E-64. La apoptosis de células inflamatorias debe ocurrir también en la cisticercosis humana y porcina. Fig. 1. Analisis por citometría de flujo de células peritoneales después de una infección intraperitoneal con metacestodos de T. crassiceps. A) CD14+ (macrofagos y eosinofilos). B) Linfocitos CD4+, CD8+ y CD19+. Fig. 2. Analisis por citometría de flujo de células peritoneales apoptóticas despues de una infección intraprertoneal con metacestodos de T. crassiceps. A) Porcentaje de células CD14+ (eosinofilos) apoptóticas medidas con Annexin A/PI. B) Porcentaje de células CD4+ apoptóticas medidas con Annexin A/PI. RESULTADOS. Los resultados revelaron una apoptosis significativa de células CD4+ y eosinófilos en diferentes tiempos post-infección. Los co-cultivos de metacestodos vivos y células de bazo de ratón sano mostraron una apoptosis significativa (P<0.001) de células CD4+ y CD8+. La apoptosis disminuyó significativamente (P<0.001) cuando se añadió E-64 (un inhibidor específico de cisteín proteasas) a los co- cultivos.

Fig. 1. Analisis por citometría de flujo de células peritoneales después de una infección intraperitoneal con metacestodos de T. crassiceps. A) CD14+ (macrofagos y eosinofilos). B) Linfocitos CD4+, CD8+ y CD19+. Fig. 2. Analisis por citometría de flujo de células peritoneales apoptóticas despues de una infección intraprertoneal con metacestodos de T. crassiceps. A) Porcentaje de células CD14+ (eosinofilos) apoptóticas medidas con Annexin A/PI. B) Porcentaje de células CD4+ apoptóticas medidas con Annexin A/PI.