Descarboxilación oxidativa del piruvato Dr. Juan Pablo Damián Área de Bioquímica Facultad de Veterinaria, Montevideo, Uruguay. UdelaR

Objetivo: comprender la descarboxilación oxidativa del piruvato y su regulación 1) Introducción - Producción de acetato. - Ubicación en la célula. Condiciones energéticas. - Complejo multienzimático de la Piruvato deshidrogenasa. 2) Pasos 3) Balance global 4) Regulación 5) Resumen

Introducción

Si se necesita Energía (ATP), y se dispone de Oxígeno qué eventos metabólicos ocurren en la célula ? Respiración Celular Se consume O2 y se produce CO2 a nivel celular.

Panorámica del metabolismo Fases o Etapas de la respiración celular

Fases o Etapas de la respiración celular Moléculas de combustible orgánico se oxidan para dar Acetil-CoA. 3 C 1 C CH3 C SCoA O 2 átomos de carbono Se incorporan grupos acetilos al ciclo de Krebs, con Liberación de CO2 y coenzimas reducidas. Los coenzimas reducidos se oxidan en la Cte- con el Consumo de O como último aceptor de e- y la producción de ATP por fosforilación oxidativa.

Fases o Etapas de la respiración celular Moléculas de combustible orgánico se oxidan para dar Acetil-CoA. CH3 C SCoA O 2 átomos de carbono Se incorporan grupos acetilos al ciclo de Krebs, con liberación de CO2 y coenzimas reducidas. 1 C 2 átomos de carbono como CO2 1 C Los coenzimas reducidos se oxidan en la Cte- con el Consumo de O como último aceptor de e- y la producción de ATP por fosforilación oxidativa.

Fases o Etapas de la respiración celular Moléculas de combustible orgánico se oxidan para dar Acetil-CoA. Se incorporan grupos acetilos al ciclo de Krebs, con liberación de CO2 y coenzimas reducidas. Los coenzimas reducidos se oxidan en la Cte-, liberando protones y electrones. Los e- son transferidos por varios trasnportadores hasta llegar al O como último aceptor de e- , y se produce ATP por fosforilación oxidativa.

Fases o Etapas de la respiración Aas tb´dan Piruvato? Mitocondria

Sin Oxígeno, el piruvato no entra en la mitocondria Oxidándose de forma incompleta a lactato. ATP ATP Aas tb´dan Piruvato? Lactato

Fases o Etapas de la respiración En presencia de Oxígeno…. Aas tb´dan Piruvato? ATP ATP ATP ATP ATP ATP ATP ATP ATP ATP ATP ATP ATP ATP ATP ATP ATP ATP ATP ATP ATP ATP ATP ATP ATP ATP ATP ATP ATP ATP ATP ATP ATP

Fases o Etapas de la respiración Aas tb´dan Piruvato? Descarboxilación oxidativa

Producción de acetato, organismos aeróbicos Los carbohidratos, lípidos y aminoácidos son oxidados a CO2 y H2O en el ciclo de Krebs y en la cadena respiratoria. La entrada de casi todos los “combustible” al Ciclo de Krebs es como Acetil-coenzima A (Acetil-SCoA o Acetil-CoA) El piruvato (proveniente de la glucólisis y del metabolismo de aminoácidos) se oxida para dar Acetil-CoA y CO2.

Ubicación celular del piruvato y condiciones energéticas La oxidación del piruvato a Acetil-CoA en las células eucarióticas se realiza en las mitocondrias y en las procarióticas en el citosol. El piruvato se produce en el citosol ¿como pasa a la mitocondria?

Fases o Etapas de la respiración Piruvato H+ Aas tb´dan Piruvato? Piruvato H+ transportador especifico (piruvato - H+ Simport).

La descarboxilación oxidativa del piruvato se “activa” cuando el nivel energético en la célula “es bajo” Si el nivel energético “es bajo” ¿como es la concentración de ATP en relación a la de ADP y Pi? La concentración de ATP es menor que la de ADP, AMP y Pi Normalmente en la célula [ATP] 5-10 mM [AMP] < 0,1 mM

Cambios relativos en [ATP] y [AMP] cuando se consume

Complejo piruvato deshidrogenasa Reacción global de la descarboxilación oxidativa del priuvato CoA-SH NAD+ NADH CO2 -O O C CH3 C S-CoA 1 C O 2 O Complejo piruvato deshidrogenasa (E1 + E2 + E3) CH3 3 Acetil-Co-A Piruvato Reacción IRREVERSIBLE ∆G’o = -33.4 kJ/mol Complejo multienzimático no puede unir de nuevo el CO2 al Acetil-CoA, reacción irreversible en condiciones fisiológicas en condiciones fisiológicas es una reacción irreversible (el complejo no puede unir de nuevo CO2), donde el piruvato pierde un grupo carboxilo como C02, al tiempo que los dos carbonos restantes se transforman en el grupo acetilo del acetil-CoA.

Complejo piruvato deshidrogenasa Reacción global de la descarboxilación oxidativa del priuvato CoA-SH NAD+ NADH CO2 -O O C CH3 C S-CoA 1 C O 2 O Complejo piruvato deshidrogenasa CH3 3 Acetil-Co-A E1 + E2 + E3 Piruvato Complejo de la piruvato deshidrogenasa (riñón bovino) micrografia crioelectrónica En mamíferos diámetro aprox 50 nm (5 veces tamaño ribosoma, visible al microscopio)

Complejo piruvato deshidrogenasa Reacción global de la descarboxilación oxidativa del priuvato CoA-SH NAD+ NADH CO2 -O O C CH3 C S-CoA 1 C O 2 O Complejo piruvato deshidrogenasa CH3 3 Acetil-Co-A E1 + E2 + E3 Piruvato

Complejo piruvato deshidrogenasa Reacción global de la descarboxilación oxidativa del priuvato CoA-SH NAD+ NADH CO2 -O O C CH3 C S-CoA 1 C O 2 O Complejo piruvato deshidrogenasa CH3 3 Acetil-Co-A E1 + E2 + E3 Piruvato Formado por copias múltiples de tres enzimas: E.coli E.coli Enzima E1 : piruvato deshidrogenasa E2 : dihidrolipoil transacetilasa E3 : dihidrolipoil deshidrogenasa N°/complejo 24 24 Bov(60) 12 N°/complejo 24 24 Bov(60) 12 E1 contiene TPP Varía según la especie E3 contiene FAD Dos proteínas reguladoras: Quinasa y Fosfoproteína Fosfatasa

Organización estructural del complejo multienzimático de la piruvato deshidrogena (E. coli) Diferencias en número de copias de cada E entre organismos Todas combinadas (60 Sub-U) E2 (24 Sub-U) E1 (24 Sub-U) E3 (12 Sub-U) E2: dihidrolipoil transacetilasa E1 : piruvato deshidrogenasa E3 : dihidrolipoil deshidrogenasa

Levadura E2 Núcleo interno (sitio activo) Lipoilo

¿Que ventajas mecanicistas tiene una reacción catalizada por un complejo multienzimático? Los intermediarios químicos que se forman permanecen unidos a la superficie de las enzimas mientras se transforma el sustrato en el producto. Lo que permite que los intermedios puedan reaccionar rápidamente sin que difundan fuera de la superficie del complejo 1) Minimiza la distancia entre el sustrato y el sitio activo de la enzima, aumentando la frecuencia de “choques”. 2) Canaliza los intermediarios metabólicos entre las sucesivas enzimas. 3) Puede ser controlada coordinadamente. Los complejos multienzimáticos son un “avance” en la evolución de la catálisis enzimática.

Complejo piruvato deshidrogenasa Reacción global de la descarboxilación oxidativa del priuvato CoA-SH NAD+ NADH CO2 -O O C CH3 C S-CoA 1 C O 2 O Complejo piruvato deshidrogenasa CH3 3 Acetil-Co-A E1 + E2 + E3 Piruvato ∆G’o = -33.4 kJ/mol Utiliza 5 coenzimas diferentes: 5 cofactores: (ión inorg. o co-E necesario para actividad de E) 1) Flavina adenina dinucleótido (FAD) unido a E3 2) Nicotinamida adenina dinucleótido (NAD), sustrato de E3 3) Pirofosfato de tiamina (TPP), (Tiamina=Vit B1) unido a E1 4) Lipoamida (ácido lipoico) o Lipoato unido a E2 5) Co-enzima A (Co-A), sustrato de la E2

Complejo piruvato deshidrogenasa Reacción global de la descarboxilación oxidativa del priuvato CoA-SH NAD+ NADH CO2 -O O C CH3 C S-CoA 1 C O 2 O Complejo piruvato deshidrogenasa CH3 3 Acetil-Co-A E1 + E2 + E3 Piruvato FAD ∆G’o = -33.4 kJ/mol Utiliza 5 coenzimas diferentes: 5 cofactores: (ión inorg. o co-E necesario para actividad de E) 1) Flavina adenina dinucleótido (FAD) unido a E3 2) Nicotinamida adenina dinucleótido (NAD), sustrato de E3 3) Pirofosfato de tiamina (TPP), (Tiamina=Vit B1) unido a E1 4) Lipoamida (ácido lipoico) o Lipoato unido a E2 5) Co-enzima A (Co-A), sustrato de la E2

oxidado oxidado Porción de adenosina en rosado (sustrato de E3) (Vitamina B2) (sustrato de E3) Porción de adenosina en rosado (unido a E3)

Complejo piruvato deshidrogenasa

Complejo piruvato deshidrogenasa Reacción global de la descarboxilación oxidativa del priuvato CoA-SH NAD+ NADH CO2 -O O C CH3 C S-CoA 1 C O 2 O Complejo piruvato deshidrogenasa CH3 3 Acetil-Co-A E1 + E2 + E3 Piruvato (TPP, LIPOATO, FAD) ∆G’o = -33.4 kJ/mol Utiliza 5 coenzimas diferentes:

Complejo piruvato deshidrogenasa

Complejo piruvato deshidrogenasa Reacción global de la descarboxilación oxidativa del priuvato CoA-SH NAD+ NADH CO2 -O O C CH3 C S-CoA 1 C O 2 O Complejo piruvato deshidrogenasa CH3 3 Acetil-Co-A E1 + E2 + E3 Piruvato (TPP, LIPOATO, FAD) ∆G’o = -33.4 kJ/mol Utiliza 5 coenzimas diferentes:

Grupo lipoilo oxidado Transorte de grupo acilo Transporte de e- Azul=dominio lipoilo E2 E2

Complejo piruvato deshidrogenasa Forma oxidada Forma acetilada Forma reducida

Complejo piruvato deshidrogenasa Reacción global de la descarboxilación oxidativa del priuvato CoA-SH NAD+ NADH CO2 -O O C CH3 C S-CoA 1 C O 2 O Complejo piruvato deshidrogenasa CH3 3 Acetil-Co-A E1 + E2 + E3 Piruvato (TPP, LIPOATO, FAD) ∆G’o = -33.4 kJ/mol Utiliza 5 coenzimas diferentes: Grupo tiol reactivo, Importnacia para transferencia de Grupos acilos o acetilos. (unión covalente: tioésteres)

Coenzima A transportadora de grupos acilo o acetilo Coenzima A (CoA) ADP ADENINA Enlace tioéster Enlace amida (vitamina) Grupo acetilo (unido como tioéster) (sustrato de E2) Coenzima A transportadora de grupos acilo o acetilo

Aas tb´dan Piruvato? Descarboxilación oxidativa AcetilCoA: Producto de la degradación de CH, Lipidos y aas compuesto de “alta energía”, ∆G’o = -31.5 kJ/mol (hidrólisis del enlace tioester, más exergónica que la del ATP que es -30.5 KJ/mol). Es el principal combustible del ciclo de Krebs: es la forma en que el ciclo del ácido cítrico acepta la mayor parte del combustible aportado

Descarboxilación oxidativa del piruvato: requiere de 5 enzimas (E1, E2, E3, y dos reguladoras), 5 cofactores y se realiza en 5 pasos o reacciones.

Los 5 pasos

Los productos intermedios permanecen unidos al complejo piruvato deshidrogenasa

Los productos intermedios permanecen unidos al complejo piruvato deshidrogenasa El C-2 pasa de un estado de oxidación (piruvato) a un aldehído, se une al TTP En forma de grupo hidroxietilo 1: descarboxilación del piruvato a hidroxietil- TPP. E1: piruvato deshidrogenasa

2: oxidación del hidroxietil a acetil y se activa la E1. Los productos intermedios permanecen unidos al complejo piruvato deshidrogenasa El grupo hidroxietilo se oxida para formar un ácido carboxílico (acetato) (2 electrones que se liberan reducen la unión disulfuro de lipoamida) 2: oxidación del hidroxietil a acetil y se activa la E1. E1: piruvato deshidrogenasa

Los productos intermedios permanecen unidos al complejo piruvato deshidrogenasa Forma reducida lipoilo 3: transesterificación con CoA. La energía de oxidación impulsa la formación de un tioéster del acetato, el acetil CoA. E2: dihidrolipoil transacetilasa

Los productos intermedios permanecen unidos al complejo piruvato deshidrogenasa Forma reducida lipoilo 4 y 5: transferencias electrónicas para la regeneración de la forma oxidada (disulfuro) del grupo lipoilo de E2

Los productos intermedios permanecen unidos al complejo piruvato deshidrogenasa 4: oxidación del grupo SH (tiol) de E2 para dar S-S (disulfuro, oxidada) E3: dihidrolipoil deshidrogenasa

Los productos intermedios permanecen unidos al complejo piruvato deshidrogenasa 5: oxidación del FADH2 de E3 a expensas del NAD+ para dar NADH (reducido). E3: dihidrolipoil deshidrogenasa Complejo preparado para iniciar un nuevo ciclo catalítico

Complejo piruvato deshidrogenasa Reacción global CoA-SH NAD+ NADH CO2 O O CH3-C-C O- O CH3-C-S-CoA Complejo piruvato deshidrogenasa Acetil-Co-A Piruvato Piruvato + CoA(SH) + NAD+ AcetilCoA + CO2 + NADH + H+

Regulación del complejo multienzimático de la piruvato deshidrogenasa

a) Inhibición por producto NADH + H+ - - Acetil-CoA

- + Regulación alostérica Inhibición por producto Acetil-CoA CoA NADH + H+ NAD+ + - ATP AMP AGs cadena Larga Ca2+

Regulación del complejo multienzimático de la piruvato deshidrogenasa b) Control por modificación covalente de E1 Activadores de quinasa Acetil-CoA NADH, ATP Regulador alostérico de la fosfatasa Reguladores alostéricos de la quinasa ATP Acetil-CoA NADH + H+ E1-OH (hidroxilada) Activa Inactiva Inactivan E1 Quinasa Fosfatasa Ca2+ ATP Piruvato ADP Ca2+ Inhibidores de quinasa piruvato ADP Ca2+ (altos) E1-OPO32- (fosforilada) Inactiva ADP Activador de fosfatasa Ca2+(alto) activa

Regulación del complejo multienzimático de la piruvato deshidrogenasa Control alostérico por productos alta [NADH] ( [ NADH ] / [ NAD + ] alta) alta [Acetil-CoA] ( [ Acetil-CoA ] / [ CoA] alta) Nivel energético alto inhiben descarboxilación del piruvato baja [NADH] ( [ NADH ] / [ NAD+ ] baja) baja [Acetil-CoA] ( [ Acetil-CoA ] / [ CoA baja]) Nivel energético Bajo estimulan descarboxilación del piruvato

Resumen Descarboxilación oxidativa del piruvato en células eucarióticas: Se realiza en la mitocondria. Es irreversible. Sustratos: piruvato, CoA(SH), NAD+ Productos: Acetil-CoA, NADH y CO2 Es catalizada por el complejo multienzimático de la “piruvato dehidrogenasa”, formado por multiples copias de E1, E2, E3 y 2 enzimas reguladoras de la E1. Requiere 5 cofactores: TPP, unido a E1; ácido lipoico, unido a E2; Co-A, sustrato de E2; FAD, unido a E3; NAD, sustrato de E3.

Tiene regulación: Alostérica por productos: [Acetil-CoA] y [NADH] “altas” inhiben la descarboxilación. b) regulación covalente: la E1 hidroxilada está “activada” y fosforilada “inactivada”. [Acetil-CoA], [NADH] y [ATP] “altas” son estimuladores de la quinasa que fosforila la E1 quedando “inactiva”. Altas [ADP], [piruvato] y [Ca2+] son inhibidores de la quinasa que fosforila E1 quedando “activa“ lo que fovorece la descarboxilación del piruvato.

Muchas gracias!!!