Reacción de ligación: Requieren de ATP y Mg++ T4 DNA ligasa Extremos cohesivos > extremos romos Liga oligos DNA y RNA a híbridos DNA-RNA DNA Ligasa de E. coli Muy baja eficiencia extremos romos No liga RNA a DNA.
Reacción de ligación: Corte son 1 ER: Vector + inserto Inserto derecho, inserto invertido, concatémeros de inserto Vector religado Vector-Vector Defosforilación del vector Relación molar inserto-vector Clonado direccionado
Relación molar Plásmido aprox 7 Kb Fragmento aprox 1.2 Kb Relación 5.8 veces Colocando 50 ng de vector Fragmento 50: 5.8= 8.6 ng para relación 1:1
TRANSFORMACION Y SELECCION Bacterias competentes: Métodos químicos: Cl2Ca, DMSO, etc Eficiencia:107 cel/mg DNA Métodos físicos: Electroporación (pulsos electricos ) Ef: 108cel/mg DNA SELECCIÓN Presión de selección : crecimiento en presencia de antibiótico
Transformación química
Controles Bacterias en medio con antibiótico (viabilidad) Bacterias en medio sin antibiótico (resistencia) Ligación vector sin ligasa (vector no cortado) Ligación vector solo con ligasa (vector no cortado y vector cortado con una sola enzima) Vector cerrado de concentración conocida (eficiencia de transformación)
Transformación electroporación
Electroporación