Tema 28. Concepto y estructura del gen T4, muantes rII y Benzer!

28. Concepto y estructura del gen contenido 28. Concepto y estructura del gen • Concepto clásico (‘collar de cuentas’) vs concepto molecular de gen • Concepto molecular de gen: Benzer y el fago T4 • Gen como unidad de estructura • Gen como unidad de cambio • Gen como unidad de función • Mapa molecular de la región rII de T4, por Benzer • Prueba de complementación • Recombinación vs complementación • Estructura de los genes

concepto clásico (mendeliano) de gen ‘factores hereditarios’: • partículas discretas e indivisibles que se sitúan en los cromosomas ordenados linealmente • unidad de estructura (recombinación intergénica), unidad de cambio o mutación (alelos) y unidad de función (fenotipos) ‘teoría del collar de cuentas’ cromosoma: agrupación lineal de genes (cuentas del collar) gen: unidad de estructura, cambio y función

concepto clásico (mendeliano) de gen ‘teoría del collar de cuentas’ gen es la unidad de mutación, recombinación y función concepto molecular de gen • DNA: el material hereditario (Avery, McLeod y McCarthy, 1944 y Watson y Crick, 1953) • teoría un gen - un enzima (Beadle y Tatum, 1941) ¿el gen es la unidad de recombinación, mutación y función?

concepto molecular de gen 80% de los mutantes eran debidos a mutaciones puntuales, el 20% llevaban deleciones Seymour Benzer "The phenomenon of genetic recombination provides a powerful tool for separating mutations and discerning their positions along a chromosome. When it comes to very close neighboring mutations, a difficulty arises, since the close two mutations are to one another, the smaller is the probability that recombination between them will occur. Therefore, failure to observe recombinant types ordinarily does not justify the conclusion that the two mutations are inseparable." Seymour Benzer y el fago T4 1955-1961, Benzer analizó 3.000 mutantes de lisis rápida (rII) -> genética molecular

rII- rII- rII+ en E. coli K

1. gen: ¿unidad de estructura?

análisis de recombinación de alta resolución desarrollado por Benzer para mapear las mutaciones rII Método desarrollado por Benzer para mapear las mutaciones rII ¿cómo trazar el mapa de los mutantes rII?, ¿qué revela este análisis?

T4 rII- infecta E. coli K, pero no la lisa

Frecuencia de Recombinantes = um FR = recombinantes / fagos totales = E. coli B Frecuencia de Recombinantes = um FR = recombinantes / fagos totales = 2 X fagos en E. coli K / fagos en E. coli B FR mínima detectada = 0,02% (2/104) el sistema permite la detección de 1/106 Control experimento: fagos P (mut rII) en E. coli K, para detrminar frecuencia de reversion (baja, pero existe) Se parte de lisados que contienen 10E9 fagos/ml y se siembran 0,1 ml (10E8 fagos/placa) E. coli K

R = 2 X fagos en E. coli K total = fagos en E. coli B Fig 7-25. Suzuki

mapa de recombinación de la región rII de T4 Fig. 9-23. Suzuki

Gen ¡no es la unidad de estructura! mapa de recombinación mapa de recombinación de la región rII de T4 Gen: ¡subdivisible por recombinación! -> recombinación intragénica (≈ recombinación intergénica) Gen ¡no es la unidad de estructura! Fig. 9-23. Suzuki La unidad de estructura es el par de bases. El análisis de Benzer detectó recombinación a ¡distancias de 3pb!

2. gen: ¿unidad de cambio? misma aproximación experimental que a pregunta 1

Uso de deleciones para el mapeo en fagos Deleción X mutación puntual -> localización rápida de mutantes puntuales! Deleciones: no revierten

mapa de deleción de la región rII de T4 mapa deleción Fig. 9-25. Suzuki Cada deleción (lineas horizontales) se identifica con un número. En el borde inferior de la figura (números arbitrarios) se identifican regiones definidas por las deleciones (Benzer, PNAS, 1961).

estructura fina de la región rII FR + Análisis de Frecuencia de Recombinantes 1º: mutación puntual X deleción 2º: mut. puntual X mut. puntual Fig 9-28. Suzuki Rosa oscuro son deleciones Técnica cartográfica para situar las mutaciones en fragmentos de DNA del fago T4 cada vez menores 40 pb

Fig. 9-24. Suzuki Cruzamientos entre deleciones (columnas) y mutaciones puntuales (filas) para mapear rII (zonas oscuras: lisis; claras: crecimiento bacteriano; puntos oscuros en controles: son revertientes)

estructura fina de la región rII FR + Gen: formado por subelementos mutables Gen ¡no es la unidad de cambio (de mutación)! Fig 9-28. Suzuki Rosa oscuro son deleciones Técnica cartográfica para situar las mutaciones en fragmentos de DNA del fago T4 cada vez menores El gen puede subdividirse en elementos mutables, dispuestos linealmente, que correspondene a pares de nucleótidos individuales 40 pb

Análisis de los sitios de mutación • gen formado por subelementos mutables • ¿todos los puntos igualmente mutables? o ¿las mutaciones se acumulan en unos y son raras en otros? ………: distribución de Poisson (azar) barras: distribución encontrada Total mutantes: 1612 Topología: localización mediante deleciones -> gen formado por subelementos mutables Topografía: ¿son todos los puntos igualmente mutables? o ¿las mutaciones se acumulan en unas zonas y son raras en otras?

puntos calientes y frios distribución no aleatoria de las mutaciones Puntos calinetes y frios!

3. gen: ¿unidad de función? -> rechazo de la teoría del collar de cuentas (1 y 2) 3. gen: ¿unidad de función?

prueba de complementación rII: ¿una o más unidades funcionales independientes? Prueba de complementación: - ensayo genético diseñado para mostrar la relación funcional de los genes - para determinar si las distintas mutaciones se encuentran en un mismo o distinto gen Recordar EUCARIOTAS!

E. coli K T4 rII- infecta E. coli K, pero no la lisa

E. coli K

prueba de complementación

3. gen: ¿unidad de función? ¡SI! gen (funcional) o cistrón 3. gen: ¿unidad de función? ¡SI! gen (posición) locus

primera imagen de la estructura molecular de un gen mapa molecular primera imagen de la estructura molecular de un gen región rII del fago T4, por Benzer mapa molecular Mapeo de la region rII por FR (frecuencia de recombinacion) - puntos: representan a 1 pb - puntos rojos: donde se encontraron mutantes

Prueba de complementacion completa control acoplamiento repulsión prueba Sólo sirve para mutantes recesivos C: para saber que la mutación no es dominante; haya recombinación si las dos mutaciones en un gen cistrón (CIS/TRANS) o gen (funcional)

Prueba de complementacion completa Prueba de complementación define grupos de complementación: - dos mutaciones no complementan si están en el mismo grupo - dos mutaciones sí complementan si están en distinto grupo grupo de complementación = unidad de función = cistrón (prueba completa CIS/TRANS) = gen= Excepciones: una mutacion produzca un monomero inactivo, pero multimero funcional una mutación que afecte a varios genes, no se complementan entre sí

recombinación  complementación no complementación sí recombinación sí complementación sí recombinación E. coli B crecen, bajo número crecen, alto número E. coli K crecen, crecen, pocos mitad de en E. coli B (la mitad de los recombinantes) < 1% de los de E. coli B

recombinación  complementación

complementación: recombinación: • nivel de proteína: mezcla de productos génicos • no hay cambio en los genomas, respecto a los parentales: sólo se produce durante el tiempo de coexistencia (• requiere 1 generación para su estudio) recombinación: • nivel de DNA • resultan nuevos genomas: se transmite a la descendencia (P y R) (• requiere 2 generaciones para su estudio)

Genes solapados genes solapados

problemas capítulos 3 y 9 problemas: 3.20-3.24 y 9.13-9.19 aprox. 1h de clase