Introducción a la espectroscopía vibracional .Conceptos básicos Estados vibracionales y energía Modos normales de vibración frecuencia de vibraciones .Técnicas Espectroscopía infrarroja Regiones del IR Grupos funcionales "Huellas digitales" Número de ondas e intensidad Reglas de selección FTIR y sus ventajas Espectroscopía Raman Dispersión inelástica de fotones (Stokes y anti-Stokes) Reglas de selección Ventajas sobre el IR Resonanacia Raman .Aplicaciones a proteínas Análisis de estructura secundaria Cálculos Asignaciones Uso de isótopos Grupos laterales

Bibliografía Campbell, I.D. and Dwek, R.A.; Biological Spectroscopy; Benjamin Cummings (1984) Cantor, C.R. and Schimmel, P.R.; Biophysical Chemistry; Vol 2, (1984). Krimm, S and Jagdeesh Bandekar, Vibrational Spectroscopy and Conformation of Peptides, Polypeptides and Proteins; Adv. Prot Chem. 38; (1986), p. 180 Susi, H and Byler, D.M.; Resolution Enhanced Fourier Transform Infrared Spectroscopy of Enzymes; Methods in Enzymology; 130, p 290 Williams, R.W.; Protein Secondary Structure Analysis Using Raman Amide I and Amide III Spectra; Methods in Enzymology; 130, p 311

Introducción a la espectroscopía vibracional Espectro electromagnético Frecuencia (Hz) Longitud de onda Tipo de radiación Tipos de transición 1020 - 1024 10-12 - 10-16 m Rayos gamma Nuclear 1017 - 1020 1 nm - 1 pm Rayos X Electrones internos 1015 - 1017 400 - 1 nm Ultravioleta Electrones externos 4.3x1014 - 7.5x1014 700 - 400 nm Visible 1012-1014 2.5 µm - 700 nm Infrarrojo Vibraciones 108 - 1012 1 mm - 2.5 µm Microondas Rotaciones 100 - 108 108 - 1 m Radiofrecuencia Inversión de spin

Estados vibracionales y energía Frecuencia de la vibración k = constante de fuerza del enlace F = -kx µ = masa reducida, para un sistema diatómico

Modos normales de vibración (3N - 5) cm-1 IR RAMAN estiramiento (sim) 1340 - + estiramiento (asim) 2349 deformación 667 O C O C O C O C

Técnicas: INFRARROJO Reglas de selección: No todas las vibraciones serán “activas” en IR Sólo aquellas en las que cambie el momento dipolar permanente durante la vibración

INFRARROJO

INFRARROJO N-H C-H C=O

FTIR Espectrometría IR con Transformada de Fourier Mejor relación señal/ruido ya que la luz no debe pasar por un monocromador. Se miden todas las frecuencias a la vez lo que da mucha mayor rapidez Puede tener una resolución de menos de 0.01 cm-1 Los espectros pasan necesariamente por una computadora lo que facilita el análisis y manejo espectral

Modos normales de vibración del grupo amida (valores para metilacetamida) estiramiento NH (3236 F) amida I (1653 F) amida II (1567 F) amida III (1299 M) C N H O amida IV (627 D) amida V (725 F) amida VI (600 M) amida VII (206 M) estiramiento NC (1096 D) estiramiento CN y CC (881 D) deformación CCN (436 D) deformación CNC (289 D)

Estructura secundaria ovillo estadístico hélice a transición a  b b antiparalela Susi, H., Timasheff, S and Stevens, L. J Biol Chem (1967) 242, 5460-5466

Estructura secundaria Estructura a Estructura b Goormaghtigh, E; Ruysschaert, J. M. and Raussens, V Biophysical Journal Volume 90 April 2006 2946–2957

Porcentajes de hélice y cadena extendida obtenidas por rayos X y FTIR Proteína % Hélice % Cadena extendida FTIR RX Carboxipeptidasa 40 39 33 30 α-Quimotripsina 12 10 50 49 Concanavalina A 4 2 60 Lisozima 41 45 21 19 Papaína 27 29 32 Ribonucleasa A 22 46

Uso de isótopos 1H2O 2H2O Efecto de la deuteración de la proteína sobre la posición de la banda amida I J. Biol. Chem. (1998) 273: 771-777

Uso de isótopos BIAP (A) apo BIAP (B) Asignación tentativa 1682 nC=O amida I (hoja b) 1660 nC=O amida I (giro) 1651–1652 1652 nC=O amida I (hélice a) 1633 1586–1577 1586–1571 nC=O COO– Asp o Glu 1547 d N-H amida II 1516–1517 n OH anillo Tyr 1443 1455 d N-2H amida II y 2HOH Asignación tentativa de las diferentes bandas en el espectro FTIR de BIAP y apoBIAP en 2H2O, pH 6.6

Uso de isótopos 1 = 27 min 2 = 63 min 3 = 180 min 4 = 21 h Efecto del tiempo en la deuteración de tripsina en 2H2O a 25º C, pD = 3.1 Eur. J. Biochem. 48, 339-344 (1974)

Isótopos y posición de las bandas FTIR de monóxido de carbono unido a citocromo c aa3 de T. termophilus. Referencia: Pinakoulaki, E.; Soulimane, T. and Varotsis, C. (2002) J. Biol. Chem. 277:32867.

Unión de ligandos

Técnicas: Raman Dispersión inelástica de fotones estados electrónicos virtuales Sir Chandrasekhara Venkata Raman, (சந்திரசேகர வெங்கடராமன்) Tiruchirapalli, Tamil Nadu -7/11/1888  Bangalore, Karnataka - 21/11/1970 Premio Nobel de Física 1930

Láser, luz monocromática muestra Láser, luz monocromática Regla de selección: Para que la vibración sea activa en Raman debe provocar un cambio en la polarizabilidad de la molécula. Monocromador, espectrógrafo Ventajas de Raman con respecto a IR Se mide en el visible o el UV donde los detectores son mucho más sensibles El agua produce una dispersión Raman muy débil La resonancia Raman permite sondear grupos asociados a cromóforos con una sensibilidad 102- 104 veces mayor

N N

Resonancia Raman Resonancia Raman Raman estado electrónico excitado estado energético virtual Resonancia Raman Raman estado electrónico basal La resonancia Raman es más intensa que la dispersión Raman, pero necesita que exista un cromóforo y sólo se intensifican las bandas debidas al cromóforo

l = 406.7 nm Das, T. K., S. Mazumdar and S. Mitra (1998). Eur J Biochem 254(3): 662-70

[hemo] = 0.34 mM [SO42-] = 400 mM SO42- Spiro, T. C. and Strekas, T. G. (1973) JACS 96: 338

Uso de isótopos Unión de óxido nítrico a superóxido reductasa de Pyrococcus furiosus l = 476 nm

Espectro IR de BSA sólida (azul) y espectro Raman de BSA en solución en amortiguador de fosfato (rojo).

Infrarrojo y Raman El fenómeno de absorción es más intenso por lo que se requieren muestras menores El equipamiento es más sencillo y de uso más flexible No presenta interferencias con otros fenómenos físicos (p. ej. fluorescencia) Se mide en el visible o UV donde los detectores son mucho más sensibles El agua produce una dispersión Raman muy débil El Raman resonante permite sondear grupos asociados a cromóforos con una sensibilidad varios órdenes de magnitud mayor

Introducción a la espectroscopía vibracional .Conceptos básicos Estados vibracionales y energía Modos normales de vibración frecuencia de vibraciones .Técnicas Espectroscopía infrarroja Regiones del IR Grupos funcionales "Huellas digitales" Número de ondas e intensidad Reglas de selección FTIR y sus ventajas Espectroscopía Raman Dispersión inelástica de fotones (Stokes y anti-Stokes) Reglas de selección Ventajas sobre el IR Resonanacia Raman .Aplicaciones a proteínas Análisis de estructura secundaria Cálculos Asignaciones Uso de isótopos Grupos laterales