Analisis de ligamiento Gisella Orjeda Este capitulo es acerca de la utilización de análisis de cruzamientos para cartografiar la posición de los genes en los cromosomas. La posición de un gen es una pieza clave en la información requerida para analizar la función del gen. Uno podría suponer que el secuenciamiento ha hecho el mapeo inservible porque revela los genes y su posición en el genoma. Sin embargo la mayoría de los genes identificados por secuenciamiento tienen función desconocida y su impacto en el organismo no se comprende.. Así los genes identificados por análisis fenotípico deben asociarse a un gen identificado por el secuenciamiento. Es este aspecto en el que el mapeo es crucial. Otro aspecto en el que es crucial es en el clonamiento posicional. Genetica General 2006-II

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Desviaciones de la segregacion independiente Una frecuencia de recombinantes significativamante menor de 50% indica que los genes estan ligados. Una frecuencia de 50% generalmente significa que los genes son independientes y residen en cromosomas separados Los experimentos de Mendel mostraron que los alelos de genes que influenciaban caracteres diversos segregaban independientemente. Esta segregacion ha sido explicada mostrando que esos genes residian en cromosomas diferentes y que los diferentes pares de cromosomas de comportan de manera independiente durante la meiosis. Pero que es lo que ocurre con pares de alelos de diferentes genes que se encuentran en el mismo cromosoma? Genetica General 2006-II

Quisiera saber quienes NO conocen a este sennor? Y saben que hace? Genetica General 2006-II

Y ahora quisiera saber quienes saben quien es este Sr Y ahora quisiera saber quienes saben quien es este Sr? Y quienes saben que hizo? Genetica General 2006-II

Alfred Sturtevant 1911 Genetica General 2006-II

A finales de 1911 en conversaciones con Morgan, de pronto me di cuenta que las variaciones en la fuerza del ligamiento, atribuidas ya por Morgan a diferencias en la separación espacial de los genes, ofrecía la posibilidad de determinar secuencias en la dimensión linear de un cromosoma. Fui a casa y pase la mayor parte de la noche produciendo el primer mapa cromosómico” Siendo aun estudiante no graduado, y como cuenta el, durante una conversación con morían, su profesor, se dio cuenta del concepto. Fue a su casa y no durmió produciendo el primer mapa genético. Genetica General 2006-II

Este es el primer mapa genético producido por Sturtevant. Genetica General 2006-II

Mapas de ligamiento principio A mayor distancia entre genes ligados, mayor probabilidad de ocurrencia de un cross-over y por lo tanto mayor proporcion de recombinantes. La idea que el tuvo, que es la idea que usamos hoy en dia esta basada en las probabilidades de ocurrencia de una recombinacion: a mayor distancia entre dos genes ligados, mayor probabilidad de que ocurra un crossing over y por lo tanto existe una mayor probabilidad de recombinantes en la progenie Genetica General 2006-II

Mapas de ligamiento: principio Existe una fuerte implicacion: la que los mapas geneticos corresponden a una distancia fisica en el cromosoma y Morgan y Sturtevant ciertamente quisieron implicar esta idea. Sin embargo debemos darnos cuenta que que los mapas geneticos son entidades construidas a partir de analisis genético y hubieran podido ser derivadas inclusive sin saber que los cromosomas existian. Genetica General 2006-II

Linkage maps principle A mayor distancia entre genes ligados, mayor probabilidad de ocurrencia de un cross-over y por lo tanto mayor proporcion de recombinantes. Determinando la frecuencia de recombinantes podemos obtener una medida de la distancia entre los genes. A partir de esta idea de probabilistica ligada a la distancia entre genes y a la proporcion de recombinantes, podremos determinar la distancia genetica entre genes ligados si conocemos la frecuencia de recombinantes en una progenie. Genetica General 2006-II

Cruce de tres puntos (1) Genetica General 2006-II Sturtevant defined one genetic map unit as the distance between genes for which one product of meiosis in 100 is recombinant. In another way , a recombinant frequency of (RF) of 0.01 is defined as 1 map unit. A map unit is sometimes referred as a centiMorgan (cM) A direct consequence of the way in which map distances is measured is that if 5 map units (5mu) separate genes A and B and 3mu separate genes A and C. then B and C should be 8 or 2 m.u apart. Genetica General 2006-II

Cruce de tres puntos(2) v+/v+. cv/cv . ct/ct X v/v . cv+/cv+ . ct+/ct+ v+ . cv. ct v . cv+ . ct+ F1 trihybrid v/v+ . cv/cv+ . ct/ct+ El three point test cross es el cruce de un triple heterocigota o “trihybrid” con un triple homocigota recesivo. V: vermilion eyes Cv crossveinless (ausencia de venas cruzadas en las alas) Ct: cut wings Genetica General 2006-II

P1 v+ . cv. ct v . cv+ . ct+ v/v+ . cv/cv+ . ct/ct+ X v/v . cv/cv . ct/ct A modo de recordatorio en la primera linea tenemos los gametos parentales En la segunda linea el cruce del tri-hibrido con el homocigota recesivo Analicemos los loci 2 a 2 Como sabemos que los parentales son v+ . cv. ct y v . cv+ . ct+ Clasificamos a la progenie según los gametos parentales y las recombinaciones y luego sumamos las clases. Genetica General 2006-II

Cruce de tres puntos (4) v . cv 268/1448= 18.5 v . ct 191/1448= 13.2 cv . ct 93/1448= 6.4 v+. ct. cv v . ct+ . cv+ v ct cv Y obteniento la proporcion, tenemos nuestro mapa genético Dado que v y cv son los que tienen una mayor proporcion de recombianates son los que estan mas lejos. Notar que el orden de nuestro mapa es diferente al orden de nuestra lista inicial que era arbitraria. Segundo podemos poner ct entre los dos pero v y cv podrian estar invertidos. 13.2 6.4 Genetica General 2006-II

Cruce de tres puntos (5) v+ . ct. cv v . ct+ . cv+ 13.2 6.4 18.5 El tercer punto a notar es que 13.2 mas 6.4 es 19.6 que es mayor que 18.5 Esto se debe a que no hemos contabilizado las dos clases de recombinantes mas raras: esto ha conllevado a que sub-estimemos la distancia entre v y cv. v . ct. cv+ v+ . ct+. cv Genetica General 2006-II

v+ . cv. ct v . cv+ . ct+ v/v+ . cv/cv+ . ct/ct+ X v/v . cv/cv . ct/ct No solo debimos haberlos contado sino que debimos contabilizarlos dos veces porque cada uno representa un doble recombiante. Genetica General 2006-II

Cruce de tres puntos (7) v+ . ct. cv v . ct+ . cv+ 13.2 6.4 19.6 Corrigiendo ese calculo nos da 284 que es exactamante 19.6 v . ct. cv+ 45+40+89+94+3+3+5+5= 284 v+ . ct+. cv 284/1448= 19.6 Genetica General 2006-II

Distancia de Haldane Funcion aditiva que toma en cuenta la distancia considerando recombinantes multiples. Genetica General 2006-II

Interferencia Cruce de tres puntos (8) Crossovers se inhiben uno al otro en una interaccion que llamamos : Interferencia Genetica General 2006-II

Como se mide la interferencia? Si los crossing over son independientes podemos usar la regla del producto para predecir la frecuencia de dobles recombinantes. 13.2 6.4 Este resultado fue consistente y nos sugiere que las dos regiones no son independientes en otras palabras hay algun tipo de interferencia: un crossover reduce la probabilidad de un crossover en una region adyacente. 0.132 x 0.064= 0.0084 0.84% of 1448 = 12 recombinantes pero solo observamos 8 Genetica General 2006-II

Como se mide la interferencia? Se calcula un termino llamado el coeficiente de coincidencia (cc) que es: frecuencia observada o numero de dobles recombinantes I = 1- frecuencia esperada 8 4 1 I = 1- = 33% 12 12 3 = Genetica General 2006-II

Coincidencia e interferencia La razón entre la frecuencia observada de CO dobles Y su frecuencia esperada 20,785 individuos examinados 0.0674 cross-overs sc-ec 0.0964 cross-overs entre ec-cv   Pr CO (sc-ec) (ec-cv)= 0.0674 x 0.0964 = 0.00650 0.00650 x 20,785 = 135 CO observados: 5 CC: 5/135= 3.7 % CI= 1- CC 96.3 % de CO esperados no ocurrirán Genetica General 2006-II

Funcion de mapeo de Kosambi La funcion de mapeo de Haldane asume que no existe interferencia lo cual incrementaria la proporcion de dobles crossovers. La funcion de mapeo de Kosambi esta basada en datos empiricos acerca de la proporcion de dobles crossovers en funcion de la variacion de la distancia fisica. Genetica General 2006-II

Usando los LOD scores para estimar el ligamiento LOD score: Logarithm of the odds ratio Calcula dos probabilidades diferentes de obtener un grupo de resultados. La primera es calculada asumiendo distribución independiente (0 = 0.5) y la segunda asumiendo un grado especifico de ligamiento (1 < 0.5). Luego la razón de las dos probabilidades se calcula y se obtiene el logaritmo de este numero. Genetica General 2006-II

LOD score Z() = log10 L(1) / L(0) LOD=2= ligamiento es 100 veces mas probable Que la independencia LOD 3= 1000 veces mas Genetica General 2006-II

mB1 mB1 R P P P P P P MB2 mB1 MB2 mB1 mB2 mB1 MB2 mB1 MB2 mB1 MB2 mB1 Genetica General 2006-II

P (recibir un gameto recombinante): /2 P (recibir un gameto parental): (1-)/2 Genetica General 2006-II

Por ejemplo, si 1 =0,1 , el valor calculado es : el LOD score Z sera: La variacion del LOD score en funcion del valor de  es: Recombination freq 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 Z()=lod score - 0,833 0,825 0,655 0,378 Genetica General 2006-II

1H 2H 3H 4H 5H 6H 7H Cumulative distance (cM) Genetica General 2006-II THE SAME GENERAL TREND WAS OBSERVED WHEN THE CRITERIA TO SELECT SUBSETS OF THE POPULATION WAS GENOTYPIC INFORMATION. THIS GRAPH IS FOR TOLUCA, MEXICO. 1H 2H 3H 4H 5H 6H 7H Cumulative distance (cM) Genetica General 2006-II

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MB2 mB1 mB2 MB1 R P Phase 1 1 Phase 2 2 Phase Genetica General 2006-II

Si se desconoce la fase Las dos fases son igualmente posibles excepto si hay desequilibrio gametico en la poblacion a la cual la familia pertenece Genetica General 2006-II

En la hipotesis de ligamiento genetico, el valor de la funcion de probabilidad (likelihood) para la familia observada Phase 1 Phase 2 Si hay independencia, el valor de probabilidad: MB2 mB1 mB2 MB1 R P Phase 1 1 Phase 2 2 Phase Genetica General 2006-II

Descendencias mas usuales Backcross o retrocruzas F2 Recombinant inbred lines Genetica General 2006-II

Backcross o retrocruza G1 D1 G1 D1 X G1 D1 G2 D2 Parental recurrente F1 G1 D1 G1 D1 G1 D1 G1 D1 Las poblaciones originadas de un cruzamiento de Backcross corresponden formalmente a descendencias haploides. G2 G1 D2 G1 G2 D2 D1 D1 Parentales: N-n r=n/N Recombinantes: n Genetica General 2006-II

RILs Genetica General 2006-II Esquema de produccion de lineas recombinantes/ A partir de cada individuo F2 se realizan autofecundaiones sucesivas escogiendo un solo individuo por familia Genetica General 2006-II

Heterocigosis Decrece en 1/2n donde n= es el numero de generaciones despues de la F1: % del genoma fijado: F5= 93.75 F6= 96.88 F7= 98.44 F10=99.80 Genetica General 2006-II

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