Contardi , Lorena Gabriela Reverendo, María Amelia CEMIC 2009 Nuevo Influenza A H1N1 Contardi , Lorena Gabriela Reverendo, María Amelia CEMIC 2009

Influenza Los virus influenza son virus pertenecientes a la familia Orthomyxoviridae 3 tipos de influenza, A, B y C Los virus B y C causan enfermedad solo en el hombre mientras que influenza A además infecta aves y otros animales Reseña sobre vigilancia y prevención de la influenza aviar y rol zoonótico. Linzitto et al. Acta Bioquímica Clínica Latinoamericana v.39 n.4 485-492, Diciembre 2005.

Síndrome Gripal Fiebre,escalofríos,malestar general Mialgias Dolor de garganta Tos no productiva, rinitis Cefalea Fatiga extrema Convalecencia: 1-2 semanas Complicaciones: Neumonía, exacerbación de problemas cardíacos ó pulmonares, encefalopatías, mielitis, síndrome de Reye, miositis, miocarditis y pericarditis Familia Orthomyxoviridae. Capítulo 8. pág 157-180. Virología médica. Guadalupe Carballal, Jose Oubiña.

Transmisión por aerosoles Periodo Incubación: 1-4 días Adultos eliminan virus: 1 día antes de los síntomas hasta 5 días Niños: > a 10 días Inmunocomprometidos: semanas a meses Familia Orthomyxoviridae. Capítulo 8. pág 157-180. Virología médica. Guadalupe Carballal, Jose Oubiña.

Influenza A Genoma de ARN segmentado y de polaridad negativa. La replicación es nuclear. Los viriones son envueltos por una cubierta lipídica proveniente de la célula huésped. En la envoltura poseen distintas proyecciones con forma de espícula. Reseña sobre vigilancia y prevención de la influenza aviar y rol zoonótico. Linzitto et al. Acta Bioquímica Clínica Latinoamericana v.39 n.4 485-492, Diciembre 2005.

Influenza A

Influenza A La HA y la NA son los antígenos claves contra los que la respuesta inmune es dirigida. Utilizados para tipificar los virus de influenza A en 16 HA y 9 NA subtipos. Emergence of a novel swine-origin influenza A virus (S-OIV) H1N1 virus in humans. J.S.Malik Peiris, Leo L.M.Poon, Yi Guan. Journal of Clinical Virology 45 (2009) 169-173

Hemaglutinina Adsorción del virus a la célula. HA se une a los residuos de ácido siálico que se encuentran en el receptor de las células Fusión de la envoltura viral con la membrana del endosoma. Clivaje en dos péptidos HA1 y HA2 Responsable de la hemoaglutinación mediante la HA1 Induce la aparición de Acs. neutralizantes Familia Orthomyxoviridae. Capítulo 8. pág 157-180. Virología médica. Guadalupe Carballal, Jose Oubiña.

El rol de la Hemaglutinina viral Hemaglutinina se une al ácido siálico Virus es incorporado dentro de la célula RNA del virus se replica en el núcleo

Neuraminidasa Integrada por 4 subunidades Enzima destructora de receptores Permite transportar al virus a través de las mucinas y destruir los receptores de la HA sobre la célula huésped Estimula la producción de anticuerpos inhibidores de la NA Familia Orthomyxoviridae. Capítulo 8. pág 157-180. Virología médica. Guadalupe Carballal, Jose Oubiña.

El rol de la Neuraminidasa viral La neuraminidasa corta la unión entre la hemaglutinina y el ácido siálico, lo que libera el virus de la célula

Ciclo de vida del virus de la Influenza

Adapted from Levine AJ. Viruses. 1992;165, with permission Subtipos de Hemaglutinina Subtype Human Swine Horse Bird H1 H2 H3 H4 H5 H6 H7 H8 H9 H10 H11 H12 H13 H14 H15 H16 Adapted from Levine AJ. Viruses. 1992;165, with permission

Adapted from Levine AJ. Viruses. 1992;165, with permission Subtipos de Neuraminidasa Subtype Human Swine Horse Bird N1 N2 N3 N4 N5 N6 N7 N8 N9 Adapted from Levine AJ. Viruses. 1992;165, with permission

Variación antigénica en Influenza A Drift antigénico o cambios menores: mutación puntual en el gen de HA y/o NA. No reconocida por su Ac correspondiente. Shift antigénico o cambios mayores: involucra grandes cambios HA y/o NA por el reemplazo de los genes de estas proteínas. epidemia pandemia Reseña sobre vigilancia y prevención de la influenza aviar y rol zoonótico. Linzitto et al. Acta Bioquímica Clínica Latinoamericana v.39 n.4 485-492, Diciembre 2005.

“Shift” antigénico: origen de las cepas pandémicas Reasociación genética entre cepas animales y cepas humanas en circulación. (1957/1968) Cepas aviarias o de mamíferos adquieren la capacidad de infectar al hombre. (1918) Cepas que desaparecieron, se mantuvieron escondidas y reaparecen luego de un período. (1977) Familia Orthomyxoviridae. Capítulo 8. pág 157-180. Virología médica. Guadalupe Carballal, Jose Oubiña.

Variación antigénica Se cree que las pandemias se generan cuando una HA y/o NA novel de la influenza aviar es adquirida a través de re-arreglos por virus humanos preexistentes o por un virus puramente aviar adaptándose eficientemente a la transmisión humana. Emergence of a novel swine-origin influenza A virus (S-OIV) H1N1 virus in humans. J.S.Malik Peiris, Leo L.M.Poon, Yi Guan. Journal of Clinical Virology 45 (2009) 169-173

Orígenes de las pandemias de influenza The Origins of Pandemic Influenza – Lessons from the 1918 Virus. Robert B. Belshe, MD. NEJM 353;21 November 24, 2005.

Nuevo Influenza A H1N1 Geographic Dependance, Surveillance and Origins of the 2009 Influenza A (H1N1) Virus. Vladimir Trifonov, Hossein Khiabanian and Raul Rabadan. NEJM 10.1056, May 27, 2009.

5 genes de origen porcino Proteínas de superficie del virus porcino 5 genes de origen porcino 1 gen de origen humano 2 genes de origen aviar

¿Por qué es el cerdo un huésped intermediario apropiado? Su tracto respiratorio expresa acido siálico (SA) α 2,3 Gal que une la influenza aviar y SA α 2,6 Gal que une la influenza humana, esto permitiría la infección con ambos virus. Ruling out Novel H1N1 Influenza Virus Infection with Direct Fluorescent Antigen Testing. Nira R. Pollock, Scott Duong, Annie Cheng, Linda L. Han, Sandra Smole, and James E. Kirby. Clinical Infectous Diseases 2009; 49: e66-8

Inicios de la pandemia

Nuevo Influenza A H1N1, 2009 PANDEMIA GLOBAL Abril: Emerge en México o en USA Se disemina en USA, Canadá y en el mundo La OMS declara alerta Mundial. Junio 3: PANDEMIA FASE 5: transmisión interhumana sostenida Junio 11: FASE 6: PANDEMIA GLOBAL

Hoy

Cambios antigénicos mayores y pandemias de influenza Año Subtipos Magnitud 1918-19 HswN1 ++++ 1946 H1N1 + 1957 H2N2 +++ 1968 H3N2 ++ 1977

Virus respiratorios: diagnóstico MÉTODOS DIRECTOS Cultivo: Gold standard clásico Rápidos: Detección de Antígenos: IF, ELISA, Inmunocro- matografía Detección de Genomas: PCR, RT-PCR, PCR a tiempo real MÉTODOS INDIRECTOS: Serología Escaso valor diagnóstico de infección reciente WHO information for laboratory diagnosis of pandemic (H1N1) 2009 virus in humans - update

Obtención de la muestra ¿Cuando? Dentro de los 3 días del inicio del cuadro Aspirado nasofaringeo Hisopados nasal/faríngeo combinado Hisopado nasofaríngeo Hisopado nasal Aspirado traqueal BAL Biopsia WHO information for laboratory diagnosis of pandemic (H1N1) 2009 virus in humans - update

Transporte y conservación Medios de transporte para virus: Caldo triptosa/Solución salina Hanks + gelatina ó albúmina al 1% + atb-antimicóticos 1% Transporte: en frío. A 4 ºC menos de 72 hs. No congelar Conservación por tiempos mayores a 72 hs –70 °C ó N2 líquido (Para aislamiento)

ASPIRADO NASOFARINGEO Métodos Rápidos Métodos clásicos Centrifugación sedimento tinción IFI Cultivo sobrenadante HEP 2 o MRC 5 ó MDCK ó LLC-MK2 ACP IFI células infectadas IFI

IFI panel respiratorio Virus sincicial respiratorio (Paramixoviridae) Adenovirus (Adenoviridae) Influenza A (Orthomixoviridae) Influenza B (Orthomixoviridae) Parainfluenza (Paramixoviridae) Ruling out Novel H1N1 Influenza Virus Infection with Direct Fluorescent Antigen Testing. Nira R. Pollock, Scott Duong, Annie Cheng, Linda L. Han, Sandra Smole, and James E. Kirby. Clinical Infectous Diseases 2009; 49: e66-8

Detección directa de antígeno: IFI en ANF Ventajas: Rápida < costo Desventaja: Personal entrenado Adecuado Nº células Requiere microscopio IF Ruling out Novel H1N1 Influenza Virus Infection with Direct Fluorescent Antigen Testing. Nira R. Pollock, Scott Duong, Annie Cheng, Linda L. Han, Sandra Smole, and James E. Kirby. Clinical Infectous Diseases 2009; 49: e66-8

Diagnóstico molecular PCR, RT-PCR PCR en tiempo real. ASPIRADO NASOFARINGEO Diagnóstico molecular PCR, RT-PCR PCR en tiempo real. Permite cuantificar WHO information for laboratory diagnosis of pandemic (H1N1) 2009 virus in humans - update

Diagnóstico molecular de nuevo H1N1 Diferentes protocolos Genes targets importantes: Gen de proteína de la matriz de influenza A Gen de hemaglutinina específico de H1N1 Gen de hemaglutinina específico para influenza estacional WHO information for laboratory diagnosis of pandemic (H1N1) 2009 virus in humans - update

Diagnóstico La OMS recomienda que los casos sospechosos de Influenza A H1N1 sean confirmados por: Ensayos RT-PCR que diferencien S-OIV de los virus de influenza estacional Aislamiento e identificación de Influenza H1N1 La detección de un aumento de cuatro veces en los anticuerpos S-OIV por neutralización o inhibición de la hemoaglutinación (HAI). WHO information for laboratory diagnosis of pandemic (H1N1) 2009 virus in humans - update Ruling out Novel H1N1 Influenza Virus Infection with Direct Fluorescent Antigen Testing. Nira R. Pollock, Scott Duong, Annie Cheng, Linda L. Han, Sandra Smole, and James E. Kirby. Clinical Infectous Diseases 2009; 49: e66-8

Experiencia del CEMIC en el diagnóstico de influenza A H1N1 Objetivos: Determinar la frecuencia de positividad en nuestro hospital del nuevo influenza A H1N1 por PCR en tiempo real Evaluar la sensibilidad del panel de virus respiratorio versus la PCR en tiempo real Evaluar la sensibilidad de un método rápido inmunocromatográfico para screening de nuevo H1N1 versus PCR en tiempo real

Métodos Inicialmente se utilizó una PCR en tiempo real con el protocolo recomendado por el CDC en el equipo de Smart Cycler II (Cepheid, CA). A partir del 1º de julio se incorporó para el diagnóstico una PCR en Tiempo Real comercial RUO (Research Use Only), el Swine Flu A Detection/ H1N1 en el equipo de Light Cycler 2.0´´ (Roche Diagnostics) La IFI se realizo con monoclonales específicos (Chemicon) sobre las células obtenidas de muestras respiratorias. El método rápido se realizo utilizando un kit inmunocromatográfico SD BIOLINE.

224 muestras respiratorias Materiales y Métodos Buenos Aires y Jujuy Desde 11/06 al 31/08/09 HNF ANF Aspirado traqueal BAL 1741 muestras respiratorias 16 muestras respiratorias RT-PCR en tiempo real Método Inmunocromatográfico (SD Bioline) 224 muestras respiratorias IFI panel virus respiratorios (Chemicon) RT-PCR en tiempo real RT-PCR en tiempo real Protocolo CDC (11/06-1/07) Light Cycler Roche (1/07-31/08)

Método rápido inmunocromatográfico

Método rápido

Método rápido inmunocromatográfico

Método rápido inmunocromatográfico

Resultados

Resultados Positividad total: 39% 38% 52% 16% n: 535 n: 972 n: 234

Resultados El porcentaje de positividad total por PCR Tiempo Real fue del 39% (686/1741) siendo del 52% en el mes de junio, 38% en julio y 16% en agosto La IFI mostró una sensibilidad global del 59% con respecto a la PCR en Tiempo Real sin embargo en los meses de junio y julio la sensibilidad fue del 64% con una especificidad del 92%

Sensibilidad panel viral Resultados Sensibilidad panel viral vs. RT-PCR en tiempo real PCR H1N1 (+) PCR H1N1(-) Total IFI FLUA (+) 45 7 52 IFI FLUA (-) 31 141 172 76 148 224 IFI RSV : 3 (H1N1 +) y 15 ( H1N1-) Sensibilidad : 59 % Especificidad : 95 % VPP: 86 % VPN:82%

Sensibilidad Inmuno-cromatografía Resultados Sensibilidad Inmuno-cromatografía vs. RT-PCR en tiempo real PCR H1N1 (+) PCR H1N1(-) Total Inmunocromatografía (+) 2 Inmunocromatografía (-) 11 3 14 13 16 Controles Flu A estacional: 2/3 . Controles Flu B estacional: 2/3 Sensibilidad : 15.4 % Especificidad : 100 % VPP: 100 % VPN: 21%

Conclusiones: La frecuencia de casos positivos para influenza A H1N1 fue variando a lo largo de los meses siendo mayor al principio de la pandemia (52%). Comprobamos que los mismos monoclonales que utilizamos para la detección de gripe estacional por IFI también detectan al nuevo influenza, pero con una menor sensibilidad (59%) que la observada para influenza A estacional (70-80%). Se comprobó que la sensibilidad del método rápido inmunocromatografico estudiado fue baja (15%) y es similar a lo publicado en otros trabajos. Poor Clinical Sensitivity of Rapid Antigen Test for Influenza A Pandemic (H1N1) 2009 Virus. Jan Felix Drexler, Angelica Helmer, Heike Kirberg et al. Emerging Infectious Diseases. Vol 15. N° 10, October 2009. Field performance of an Inluenza Rapid Diagnostic Test in an ambulatory setting. Isabelle Rouleau, Hugues Charest, Monique Douville- Fradet, JCM..00762-09

Muchas gracias por su atención!!

Agradecimientos: Laboratorio de Virología Dra. Cristina Videla Dr. Alfredo Martínez A nuestras compañeras de residencia