Estimulación de Linfocitos y Cultivo Celular 1065. Inmunología Aplicada Enseñanza Experimental Estimulación de Linfocitos y Cultivo Celular
Material 1 estuche de disección 6 agujas hipodérmicas 2 vasos de precipitado de 150 mL 1 tubo de cultivo estéril de 15 mL 1 micropipeta (200-1000 mL) 1 micropipeta (20-200 mL) 1 micropipeta (2-20 mL) Puntas para micropipetas estériles 1 piseta 1 gradilla 1 tubo para microcentrífuga estéril 1 microplaca para cultivo con 24 pozos 1 cámara de Neubauer
Material 1 jeringa estéril de 5 mL 1 caja Petri estéril 3 pipetas estériles de 5 mL 2 tubos de 13x100 estériles con tapón de gasa 10 gasas estériles NOTA. Material por equipo.
Reactivos Medio RPMI sin suplementar Medio RPMI suplementado (piruvato, estreptomicina/penicilina, suero fetal bovino, aminoácidos no esenciales, glutamina) Etanol al 70% Azul tripano al 0.04% Concanavalina A en concentración óptima Éter etílico
Material biológico 1 ratón de la cepa BALB/c de 25 días de edad
Obtención de células esplénicas Anestesiar al ratón en una cámara con éter Obtener el bazo quirúrgicamente y colocarlo en la caja Petri Perfundir gota a gota con 5 mL de medio RPMI no suplementado Transferir la suspensión celular al tubo de 15 mL con tapón Centrifugar a 1500 rpm durante 10 minutos (lavar 2 veces en las mismas condiciones) Resuspender el botón celular en 5 mL de RPMI suplementado
Cuenta de linfocitos Realizar una dilución 1:20 de la suspensión de linfocitos con azul tripano en un tubo para microcentrífuga Tomar 10 mL de la dilución anterior y llenar la cámara de Neubauer Realizar el conteo de linfocitos viables en el microscopio a un aumento de 40X Ajustar la suspensión de linfocitos con RPMI suplementado a 106 cel/mL
Cultivo celular Llenar 3 pozos con 500 mL de la suspensión de linfocitos ajustada Adicionar 500 mL de Concanavalina-A 2.5 mg/mL LINFOCITOS ESTIMULADOS Adicionar 500 mL de RPMI suplementado LINFOCITOS CONTROL Incubar la microplaca a 37°C con atmósfera de CO2 al 5% durante 24 h Revisar el cultivo en un microscopio invertido con contraste de fases