Búsqueda de antibióticos: Rastreo

ANALISIS DE GENOMAS MICROBIANOS Virulencia, adaptación al hospedador y evolución

ANALISIS DE GENOMAS MICROBIANOS Virulencia, adaptación al hospedador y evolución

Secuencia Genómica Implica la secuenciación de una librería compuesta por fragmentos aleatorios redundantes que abarcan todo el genoma y se genera por cortes aleatorios (Shotgun). Se secuencia entre 6 y 10 veces. Tras la secuenciación se ensambla, se rellenan huecos, se anota y se localizan y predicen los posibles genes La disponibilidad de la secuencia completa ofrece un repertorio de todos los factores de virulencia e inmunógenos potenciales

Análisis de la diversidad Variable contenido cromosómico: ” las bacterias contienen un único cromosoma circular y ocasionalmente plásmidos circulares” Vibrio Cholerae: 2 chrom. circulares (2,69 y 1,07 Mb) Borrelia burgdorferi: 1 cromosoma lineal (0,91 Mb) y 17 plásmidos lineales y circulares Variable contenido G +C: Borrelia burgdorferi: 29 % G+C Mycobacterum tuberculosis: 65% G+C Descripción genética muy limitada: Escherichia coli: ≈ 40% de sus genes sin función conocida Mecanismos de diversidad y virulencia: Transferencia lateral de genes causantes de virulencia. Decaimiento genómico y adaptación al hospedador Variación de fase y antigénica.

Transferencia lateral de genes Mecanismo de diversificación de la virulencia: muy documentada entre patógenos entéricos. Mecanismos: Transformación Conjugación (transposones, plásmidos) Transducción (bacteriófagos) Recombinación genómica. La transferencia implica grupos de genes (de 5 a 100 kb)y puede convertir un organismo benigno en otro patógeno. Si contribuyen a la virulencia se denominan PI (pathogenicity islands). Ejemplos de PI: sistemas de secreción tipo III y tipo IV

Transmisión lateral de genes de virulencia: Sistemas de secreción bacterianos tipo III y tipo IV Codifican estructuras especializadas que actúan como jeringuillas moleculares para introducir moléculas efectoras (generalmente toxinas) en la célula hospedadora Presentes en bacterias patógenas Gram negativas Los genes que codifican estas estructuras están muy conservados entre bacterias y se piensa que se han transmitido por transferencia lateral Las moléculas efectoras que inyectan son específicas de cada tipo de bacteria. Tipo III en: E.coli, Slamonella enterica, Bordetella bronchiseptica, Pseudomonas areuginosa, Chlamydia, Shigella y Yersinia spp. Tipo IV en : H. pylori, E. coli, B. pertusi Legionella pneumophila.

Transmisión lateral de genes de virulencia: Detección de las Islas de patogenicidad por análisis genómico. Base teórica: Los loci adquiridos por transmisión lateral poseen un contenido de G+C relativo distinto del resto del genoma. Este hecho permite el análisis informático de la secuencia total de un genoma para localizar picos de variación en el contenido de G+C Se puede así medir y comparar el efecto de la transmisión lateral de genes entre patógenos. Primeros estudios: Confirman que las bacterias han sufrido frecuentemente transferencia de genes. Muchos de estos genes pueden ser determinantes de la virulencia. Helicobacter pylori (26695) presenta 30 picos de variación G+C y Campylobacter jejuni muy poca evidencia de transferencia lateral de genes. Sus genes housekeeping son muy similares mientras que los genes responsables de su patogenicidad son muy divergentes. Helicobacter pylori (26695) y Helicobacter pylori (j99) poseen un 7% de genes diferentes agrupados en una región hipervariable del genoma denominada zona de plasticidad. Neisseria meningitidis serotipo B es una bacteria naturalmente competente con un genoma de 2.23Mb y una gran evidencia en su genoma de múltiples sucesos de transferencia lateral de genes: 1.910 señales de captación de DNA. Tres grandes regiones de variación en G+C (dos con genes de patogenicidad. Vibrio Cholerae. Se ha sugerido que su segundo cromosoma es un megaplásmido

Decaimiento genómico: Generalizaciones: La perdida de genes se incrementa con la adaptación al hospedador. Incremento del uso de los procesos celulares del hospedador Fenómeno muy evidente en parásitos intracelulares. Primeros estudios: Ricktessia prowazeki (genoma de 1.11 mb). Pose muchos pseudogenes y la mayor proporción de DNA no codificante entre procariotas (> 24%). sPerdida de genes no necesarios para su vida intracelular. Genoma sorprendentemente similar al mitocondrial. F Mycobacterium leprae presenta numerosos pseudogenes. Metabolismo muy restringido y rango de hospedadores muy estrecho. Mycobacterium genitales Mínimo numero de genes entre los seres vivos con el mínimo número de genes (Micobaterias). Genoma de 0.58Mb Yersina pestis se encuentra en una situación intermedia. Por un lado aumento del genoma por transferencia vertical. Adquisición de tres plásmidos (uno genera virulencia: sistemas de secreción de tipo III). Por otra parte sufre reducción del genoma por decaimiento. Al menos presenta 100 genes interrumpidos.

Variación de fase/Variación antigénica: Definiciones: Variación de fase: la perdida o ganancia reversible de características fenotípicas como resultado de cambios de expresión de uno o varios genes. Variación antigénica: la variación de las estructuras superficiales del microorganismo patógeno. Ambas son estrategias de supervivencia comunes en bacterias patógenas. Mecanismos: Deslizamiento de una cadena por mal apareamiento de bases en zonas se secuencia repetida durante la replicación. Genes de contingencia: genes con variaciones en secuencias repetidas simples de uno hasta cinco nucleótidos. Casi exclusivos de patógenos de mucosas con genomas relativamente pequeños Generalmente asociados con síntesis de estructuras de la superficie celular o con genes del sistema de restricción/modificación del DNA Tracts homopoliméricos: unidades repetitivas de un nucleótido. Mecanismo alternativo de variación antigénica es la duplicación de genes. Consecuencia: La alteración de la longitud de estas zonas inmediatamente antes de secuencias codificantes puede situar a los genes fuera de fase y afectar a su expresión Se producen cambios fenotípicos en bacterias individuales dentro de una población en crecimiento clonal. Escape de los mecanismos de defensa inmunitaria del hospedador

Variación de fase/Variación antigénica: H. influenzae: Una docena de genes de contingencia con tracts homopoliméricos. Cuatro de ellos implicados en la síntesis de lipopolisacáridos Cuatro implicados en la captación de hierro. H. Pylori: Presenta veintisiete genes de contingencia potenciales. Dos de ellos son genes para la a-3-fucosiltranferasa, enzima responsable de la expresión variable de los antígenos de superficie Lewis X y Lewis Y. N. Meningitidis: Serotipo B línea MC58: 65 genes de contingencia potenciales. La mayoría de ellos implicados en procesos de interacción con el hospedador (proteínas de membrana, pili, lipopolisacáridos, cápsulas) Serotipo A línea Z2491: Contiene cientos de elementos repetidos, desde cortos tracts homopoliméricos hasta duplicaciones completas de genes. Extrema fluidez genómica C. Jejuni: 25 genes de contingencia agrupados en tres zonas del genoma donde se localizan los genes responsables de la síntesis de lipopolisacáridos (LOS), de la síntesis de la cápsula y de la síntesis del flagelo. Ejemplo: síntesis de la ß-1,3 galactosiltransfereasa responsable de la síntesis del gangliósido GM1

Objetivos de agentes microbianos y vacunas Perspectivas: Los análisis de genomas completos producirán un inventario completo de los genes que codifican cada uno de los factores de virulencia y cada uno de los agentes inmunogénicos susceptibles de ser atacados. Vacunas de DNA: El DNA es un atractivo agente inmunogénico: Es estable y fácil de producir. ELS o GI (expression library screening or genomic immunization): Inmunizar animales con mezclas de fragmento de DNA y re-examinar los que den respuesta inmunitaria fuerte para identificar el DNA causante. La disponibilidad de genomas completos permite el diseño racional de vacunas por este método. Ejemplo: Mycoplasma pulmonis. Identificación de antígenos de superficie: N. Meningitidis tipo B MC58 2158 secuencias de proteínas. 570 antígenos de superficie potenciales, excluidos los genes de contingencia. Expresión de los 570 en E. Coli. Solo 350 pudieron expresarse Inmunización de ratones con los 350 expresados 85 proteínas dieron una respuesta inmunogénica fuerte y se evaluó la respuesta bactericida de los anticuerpos in vitro. Evaluación de su conservación entre serotipos mas comunes de N. meningitidis: 7 candidatos. Los siete candidatos son antígenos de superficie cuya eficacia como vacuna está en evaluación. Generación de patógenos, atenuados por ingeniería genética, como vacunas:

Inmunización Genética

Inmunización Genómica Librería de expresión (EL) Selección de los antígenos más inmunogénicos

Genómica funcional: Localización de genes importantes en el proceso patológico La adquisición y el análisis de las secuencias genómicas no es el objetivo final, sino un punto de partida. Las Homologías dan ‘ pistas ’, pero no demuestran la función de los genes. Un número elevado de genes existentes en los patógenos codifican proteínas de función desconocida. Es preciso volver al “laboratorio húmedo” Técnicas de alto rendimiento-Genómica funcional: Análisis por mutagénesis. Hibridación de ácidos nucleicos Química de proteínas. Bioinformatica

Genómica funcional 1) Análisis de la activación de genes (Mutagénesis) IVET: In vivo expression technology DFI: Differential fluorescence induction STM: Signature -tagged mutagenesis GAMBIT: Genomic analysis and mapping by in vitro transposition 2) Análisis de Transcriptomas DNA chips o micro-arrays SAGE: Serial analysis of gene expression DD:Differential display 3) Análisis de Proteomas 2D PAGE Espectrometría de masas Protein micro-arrays

Genómica funcional: Localización de genes importantes en el proceso patológico Principio básico “ El grupo de genes que expresa un organismo patógeno en su reservorio ambiental difiere sustancialmente del grupo de genes que expresa durante su etapa patógena.” Resulta probable que algunos genes inducidos in vivo (en el hospedador) jueguen un papel crítico en el proceso patogénico. ¿Es posible diseñar técnicas de captura de dichos genes?

IVET In Vivo Expression Technology

Tecnologías de expresión in vivo IVET Método de selección positiva: Sistema de selección de promotores de genes activados durante el proceso infectivo y que están poco o nada activos en el periodo no infectivo Proceso: Dos genes marcadores situados en tandem se fusionan aleatoriamente con fragmentos del genoma del microorganismo a estudiar generando una librería de fragmentos genómicos Se transforman las cepas a estudiar con la librería de fragmentos genómicos. 3. Se infecta al animal y se extraen las células supervivientes. Principio: El primer gen del tandem permita la supervivencia in vivo si es expresado. El segundo gen del tandem (lacZY) permite distinguir las cepas que se expresan in vitro: Color azul. Interesan los clones supervivientes que no se expresan in vitro: Colonias blancas extraídas del animal infectado. Genes testigo: ∆purA, selección auxotrófica Genes de resistencia a antibióticos

Tecnologías de expresión in vivo IVET Método de selección negativa: Permite la detección de actividad de promotores durante un período muy corto de la infección Principio: Si el promotor esta activo la resolvasa eliminará el gen de resistencia a tetraciclina y por tanto el microorganismo pasara de resistente a sensible. Se añade tetraciclina in vitro y se buscan células sensibles a tetraciclina y blancas.

Tecnologías de expresión in vivo IVET IVET con selección auxotrófica: Genes testigo: purA y lacZ Salmonella typhimurium (se utilizó una cepa ∆pur A) La disponibilidad de las purinas es limitante para el crecimiento de esta bacteria cuando infecta ratones Pseudomonas areuginosa Se identificaron loci implicados en susceptibilidad. IVET con selección antibiótica: Genes testigo: resistencia a cloranfenicol y lacZ Salmonella typhimurium En ratones Balb/c y en macrófagos en cultivo. Junto con la anterior se han identificado mas de 100 genes ivi, la mitad de ellos de función desconocida. Yersinia enterocolítica Se han identificado 48 genes. La mitad similares a otros conocidos, unos pocos con función desconocida pero similares a otros ya descritos y 18 completamente nuevos. IVET con resolvasa: Genes testigo: resolvasa y lacZ, además las cepas estudiadas portan una resistencia a tetraciclina. Vibrio cholerae Identificación de 13 genes ivi. Algunos homólogos a genes implicados en el metabolismo de aminoácidos, otros homólogos a genes de función desconocida o completamente nuevos. Staphylococcus aureus Identificados 45 genes ivi. Varios previamente conocidos. El resto similares a genes conocidos de otras especies o nuevos.

Differential Fluorescence Induction Método de selección positiva: Como gen testigo se utiliza la GFP (Green Flourescent Protein) Se utiliza un sistema automático de selección de células individuales según su fluorescencia FACS. Principio: Si el promotor está activo se sintetiza la GFP y la bacteria fluoresce. Se cultivan in vitro las bacterias fluorescentes in vivo y se seleccionan aquellas que pierden su fluorescencia en el nuevo medio. Salmonella thyphimurium.: Identificados 14 genes inducidos en macrófagos. 8 poseen homólogos en otras bacterias con función conocida 6 sin homología con otros genes u homólogos a genes de función desconocida

Differential Fluorescence Induction Salmonella typhimurium

Genómica funcional 1) Análisis de la activación de genes (Mutagénesis) IVET: In vivo expression technology DFI: Differential fluorescence induction STM: Signature -tagged mutagenesis GAMBIT: Genomic analysis and mapping by in vitro transposition

Tecnologías de expresión in vivo IVET IVET con selección auxotrófica: Genes testigo: purA y lacZ Salmonella typhimurium (se utilizó una cepa ∆pur A) La disponibilidad de las purinas es limitante para el crecimiento de esta bacteria cuando infecta ratones Pseudomonas areuginosa Se identificaron loci implicados en susceptibilidad. IVET con selección antibiótica: Genes testigo: resistencia a cloranfenicol y lacZ Salmonella typhimurium En ratones Balb/c y en macrófagos en cultivo. Junto con la anterior se han identificado mas de 100 genes ivi, la mitad de ellos de función desconocida. Yersinia enterocolítica Se han identificado 48 genes. La mitad similares a otros conocidos, unos pocos con función desconocida pero similares a otros ya descritos y 18 completamente nuevos. IVET con resolvasa: Genes testigo: resolvasa y lacZ, además las cepas estudiadas portan una resistencia a tetraciclina. Vibrio cholerae Identificación de 13 genes ivi. Algunos homólogos a genes implicados en el metabolismo de aminoácidos, otros homólogos a genes de función desconocida o completamente nuevos. Staphylococcus aureus Identificados 45 genes ivi. Varios previamente conocidos. El resto similares a genes conocidos de otras especies o nuevos.

Signature-tagged mutagenesis

Signature-tagged mutagenesis DNA tag (o código de Barras

Signature-tagged mutagenesis

Signature-tagged mutagenesis

Factores limitantes de la STM STM evalúa la capacidad del patógeno para dividirse en una población heterogénea. Se espera que identifique genes de virulencia no compensables por otros patógenos virulentos del mismo inóculo. Factores determinantes: La complejidad del inóculo. La dosis La ruta de administración La duración de la infección

Desventajas de IVET y STM Dependen demasiado de la no expresión de genes “in vitro”. Desestima los genes que deban atenuarse durante la infección. Los genes ivi deben ser mutados posteriormente para demostrar su requerimiento en la infección. No detecta genes esenciales STM: No selecciona positivamente. La mutagénesis puede no ser verdaderamente aleatoria. No detecta genes esenciales.

GAMBIT Aplicación práctica (Genomic analysis and mapping by in vitro transposition) Principio: Sistema de identificación de genes esenciales para la supervivencia del microorganismo Útil en organismos cuyo genoma esta completamente secuenciado. Utiliza la técnica de footprinting por PCR Precisa de unos 130 cebadores por Mb de DNA investigado Sistema de selección negativo Aplicación práctica Haemophilus influenzae. En crecimiento in vivo y en infecciones en animales (ratón) Streptococcus pneumoniae. En crecimiento in vitro

GAMBIT (Genomic analysis and mapping by in vitro transposition)

GAMBIT (Genomic analysis and mapping by in vitro transposition)