UNIVERSIDAD NACIONAL AUTONOMA DE MEXICO Estudio del mecanismo de regulación transcripcional por la proteína RhlR de Pseudomonas aeruginosa. Presentado por: Gerardo Enrique Medina Basulto Tutor: Dra. Gloria Soberón Chávez Instituto de Biotecnología Doctorado en Ciencias Bioquímicas

INTRODUCCION

Bacteria Gram negativa Patógeno oportunista Fibrosis quística QuemadurasInmunodeficiencia Producción de factores de virulencia RamnolípidosProteasasToxinasPigmentos Ubicua en la naturaleza Genoma de 6.3 Mpb Gran versatilidad metabólica 67% de G+C en su genoma Pseudomonas aeruginosa

OrganismoFenotipoAutoinductor sintetasa Regulador transcripcional Autoinductor Agrobacterium tumefaciens ConjugaciónTraITraROOHL Chromobacterium violaceum Antibióticos,exoenzimas, violaceina CviICviRHHL ErwiniacarotovoraAntibioticos,exoenzimasCarICarROHHL ErwiniastewartiiExopolisacáridoEsaIEsaROHHL EscherichiacoliDivisióncelular ? SdiA ? Vibrio (Photobacterium) fischeri BioluminiscenciaLuxILuxROHHL,HHL Pseudomonas aeruginosa Proteasaalcalina, elastasa,exotoxinaA, exoenzimaS, neuraminidasa, hemolisina. Quitinasa,elastasa, piocianina, ramnolípidos,RpoS LasI RhlI LasR RhlR OdDHL BHL SerratialiquefaciensMotilidad,fosfolipasaSwrL ? BHL Algunos sistemas detectores de quórum en bacterias gram-negativas

Regulación de la transcripción Multime- rización Unión a AHL LuxR AHL transcripción Promotor blanco ARN polimerasa ADN Caja lux 5´3´ N-terminal C-terminal gen Dominios de la proteína LuxR y modelo de activación de la transcripción por dicha proteína HTH activación

luxI C D A B E G luxR Caja lux LuxR LuxI OHHL + Regulación de la bioluminiscencia en Vibrio fischeri

Modelo de la biosíntesis de HHL catalizado por LuxI en V. fischeri

TDP-L-ramnosa TDP (CH 2 ) 6 CH 3 HO CH CH 2 CO S ACP Biosíntesis de ramnolípidos mostrando las reacciones catalizadas por RhlAB y RhlC en P. aeruginosa. OPO O PO OH CH 3 O OH CH 3 OH O O O O P O Timidina dTDP-L-ramnosa  hidroxidecanoil-ACP + Lipopolisacáridos RhlAB TDP L-ramnosil-  -hidroxidecanoil-  - hidroxidecanoato (CH 2 ) 6 CH 3 (CH 2 ) 6 CH 3 O O CH CH 2 CO OH O CH CH 2 COOH O CH 3 OH  L-ramnosil-L-ramnosil-  -hidroxidecanoil-  - hidroxidecanoato  RhlC (CH 2 ) 6 CH 3 (CH 2 ) 6 CH 3 O O CH CH 2 C O CH CH 2 COOHO OHO CH 3 O OH O CH 3 OH

BHL RhlR autoinductor sintetasa RhlR + ? + rhlArhlBrhlRrhlI + rhlC - RhlR autoinductor sintetasa RhlR + ? + rhlArhlBrhlRrhlI + rhlC Ramnolípidos - Modelo regulatorio de la producción de ramnolípidos en P. aeruginosa LasR OdDHL +

OBJETIVOS

Objetivo general -Estudiar la regulación transcripcional de los genes rhlA y rhlR de Pseudomonas aeruginosa así como la interacción de la proteína RhlR con la región promotora de rhlA. Objetivos específicos -Determinar cuales son los factores involucrados en la expresión del gen rhlA y las condiciones necesarias para su expresión. -Establecer el o los sitios de unión de la proteína RhlR a la región promotora del gen rhlA y las condiciones en que se presenta dicha interacción. -Determinar cuales son los factores involucrados en la expresión del gen rhlR, sus inicios transcripcionales y las condiciones necesarias para su expresión.

RESULTADOS

Silenciamiento en fase exponencial del promotor rhlAB.

Las lineas 1, 2 y 3 muestran la expresión de RhlR a las 2, 4 y 8 horas de crecimiento respectivamente. Las lineas 4, 5 y 6 muestran la expresión de RhlR a las 2, 4 y 8 horas en cultivos con 10  M de C4-HSL y 0.1mM de IPTG. Inmunodetección de RhlR a lo largo de la curva de crecimiento en la cepa PAO1/pECP61.5 en medio PPGAS M R Expresión de rhlA::lacZ en la cepa PAO1/pECP61.5 a lo largo de la curva de crecimiento en medio PPGAS. Tiempo (horas) D. O. 600nm Unidades miller ,01 0, PPGAS D. O. 600nm AIPTG D. O. 600nm PPGAS AIPTG

Inmunodetección de RhlR a lo largo de la curva de crecimiento en la cepa DH5  /pECP61.5. Las lineas 1, 2 y 3 muestran la expresión de RhlR a las 2, 4 y 8 horas de crecimiento respectivamente. Las lineas 4, 5 y 6 muestran la expresión de RhlR a las 2, 4 y 8 horas en cultivos con 10  M de C4-HSL y 0.1mM de IPTG M R Expresión de rhlA::lacZ en la cepa DH5  /pECP61.5 a lo largo de la curva de crecimiento. Tiempo (horas) D. O. 600nm Unidades miller , LB D. O. 600nm AIPTG D. O. 600nm LB AIPTG

0, Tiempo (horas) Unidades miller O. D. 600nm MC nm MC4100 AIPTG 600nm JV nm JV1065 AIPTG 600nm MC4100 MC4100 AIPTG JV1065 JV1065 AIPTG A Tiempo (horas) Unidades miller D. O. 600nm 0,01 0, PAO1 600nm PAO1 AIPTG 600nm PAS1 600nm PAS1 AIPTG 600nm PAO1 PAO1 AIPTG PAS1 PAS1 AIPTG B Efecto de una mutación en el gen rpoS en la expresión de rhlA en E. coli (A) y en P. aeruginosa (B).

Cinética de la expresión de rhlA en presencia de RhlR o LasR en E. coli.

Mecanismo de regulación transcripcional del promotor rhlAB por RhlR.

I II III G A T C Mapeo del sitio de inicio transcripcional de rhlA y nivel de expresión en diferentes cepas de E. coli. de expresión en diferentes cepas de E. coli. I.DH5  /pECP61.5 II.ET8000/pECP61.5 III.GMN01/pECP Ausencia de BHL + Presencia de BHL

C F C F prhlA frio C4-HSLC12-HSL Retardamiento en gel de un fragmento conteniendo el promotor de rhlA C F RhlR A B C Carriles 1A, 1B, 1C.- Fragmento sin RhlR Carril 2C.- Fragmento + RhlR -AI

GGCGGCCGCCCGTCCTGTGAAATCTGGCAGTTACCGGGCGGCCGCCCGTCCTGTGAAATCTGGCAGTTACCG -35 las boxlas box * * * * * * Protección in vivo de la región promotora de rhlA por RhlR 1. DH5  /pMPCG-pUCP20 +AI 2. DH5  /pMPCG-pGMYC +AI 3. DH5  /pMPCG-pUCP20 +IPTG 4. DH5  /pMPCG-pGMYC +IPTG G A T C *

Expresión de rhlA en la cepa DH5  /pECP61.5 en presencia de diferentes concentraciones de IPTG. presencia de diferentes concentraciones de IPTG LB AI 10  M AIPTG 0.1AIPTG 0.5 Unidades miller 30 M R AI 10  M AIPTG 0.1 AIPTG 0.5

Unidades miller 1.- PAO1/pECP61.5 PPGAS 2.- PAO1/pECP C4HSL 3.- PAO1/pECP C4HSL + 1mM IPTG M R Expresión de rhlA y concentración de RhlR en Pseudomonas aeruginosa.

Expresión de una fusión rhlA::lacZ en la cepa DH5  de E. coli. DH5  de E. coli. Plásmido NA AI IPTG AI + IPTG pMPCG 2.3  0.7 (1.4) 4.1  0.3 (2.6) 1.9  0.4 (1.2) 1.9  0.4 (1.2) pMPCG/pGMYC 1.5  0.2 (0.9) 157  14 (100) 1.2  0.2 (0.7) 130  12 (83) pMPCG/pMT1 0.6  0.2 (0.3) 12.3  1.3 (7.8) 0.6  0.3 (0.3) 12.1  0.4 (7.6) Actividad  -galactosidasa (%)*

RNP RhlR las box las box las box BHL RNP RhlR RNP RhlR A BI BII Modelos propuestos de la interacción de RhlR con el promotor de rhlA y con la ARN polimerasa ya sea en promotor de rhlA y con la ARN polimerasa ya sea en presencia o ausencia de autoinductor presencia o ausencia de autoinductor

Regulación transcripcional del gen rhlR.

Absorbancia a 600nm PAO1/1002 LB PAO1/1002 PPG PAOR1/1002 LB PAOR1/1002 PPG Unidades miller (1x10 3 ) Expresión de rhlR::lacZ en una cepa de P. aeruginosa mutante en el gen lasR.

Unidades miller (1x10 3 ) Absorbancia a 600nm PG201 LB PG201 PPGAS 65E12 LB 65E12 PPGAS Expresión de rhlR::lacZ en una cepa de P. aeruginosa mutante en el gen rhlR

Absorbancia a 600nm Unidades miller (1x10 3 ) PAK LB PAK PPGAS PAKN1 LB PAKN1 PPGAS Expresión de rhlR::lacZ en una cepa de P. aeruginosa mutante en el gen rpoN.

Inicios transcripcionales de rhlR en P. Aeruginosa en medio PPGAS crecida a 1.5 de Abs. 600nm. A C T A G P1 P2 P3 1.PAO1 2.PAOR1 (lasR - ) 3.PAK 4.PAKN1 (rpoN - ) B C T A G P3 P2 P1 1.PG E12 (rhlR - ) 3.PAKN1 4.PAK 5.PAS1 (rpoS - )

Inicio transcripcional mas distal de rhlR en P. Aeruginosa crecida en PPGAS a 1.5 Abs. 600nm A C T A G 1 2 P4 1.PAO1 2.PAOR1 (lasR - ) B C T A G 1 2 P4 1.PAO1 2.PAO9001 (vfr - )

-24 GGCGTTTCAT rhlB GTGCCGAGGT GCTGCT CC TGCGCCCACG ACCAGTTCGA CAATGCCGAA -348 CGGCTGGTCC GGCTCGGCTG CGGGATGCGC CTGGGCGTGC CATTGCGCGA GCAGGAGT TG CGCGGGCTGGT CGCTTGC TCGAGGACCC GGCCATGGCG VFR GCGGCCTGTC GGA A TTGTCA CAACCGCACA GTATCGCTTG-198 CGGTAAAGCG GCCCAGGTGGTCGAACGTTG TCATAGG G AG GGGGATGCGC -148 GATGGCTGAA GGCTGCGTCC TGAACGGTGC TGGCATAACA GATAGGGTTG -98 CCATGATTTT GCCGTATCGG CAAGGCTGCG CGCTTGACAG CGTCATACCC CGGGCCAATT CTGCTG T GAT GCA T TTTATC GATCAGGGCT TACTGCAATG +3 AGGAATGACG GAGGCTTTTT GCTGTGGT GACGGTTTGC GTAGCGAGAT G +54 P1P2 P3 rhlR las box P4 pRD58-1 las box 3 las box 2 Oligo 2 Oligo 1 Secuencia nucleotídica de la región corriente arriba de rhlR mostrando los elementos reguladores importantes.

rhlAB rhlI lasB rhlR1 rhlR2 rhlR3 T C C T G T G A A A T C T G G C A G T T C C C T A C C A G A T C T G G C A G G T A C C T G C C A G T T C T G G C A G G T G G C T G C G C G C T - T G A C A G C G C G G T G C T G G C A - T A A C A G A T C C C T G C G C C C A CG A C C A G T T Alineamiento de las probables cajas las encontradas en la región reguladora de rhlR con otras cajas las reportadas. A A N T G T G A N N N N N N T C A C A N T T A A A T G T G A T C T A G A T C A C A T T T A A T T G T C A - C A A C C G C A C A G T A E. coli CRP lasR rhlR Alineamiento de la probable caja VFR encontrada en la región reguladora de rhlR con la caja VFR presente en lasR y con la secuencia consenso para la unión de CRP de E. coli.

AI+IPTG Unidades miller Expresión de rhlR::lacZ en una fusión que carece de una de las probables cajas las en E. coli DH5  /pRD58-1 DH5  /pRD58-2

Influencia del medio de cultivo en la expresión de rhlR y en la producción de ramnolípidos.

Glucosa 1.5% 150mM NH 4 Cl Glicerol 0.75%Gluconato 1.5% Expresión de rhlR y producción de ramnolípidos en fase estacionaria tardía de la cepa PAO1 en medio M9 modificado Unidades miller  g/ml Concentración de ramnolípidos Actividad  galactosidasa

Expresión de rhlR y producción de ramnolípidos en fase estacionaria de la cepa PAO1 en medio PPGAS modificado. Unidades miller Tris HCl+PO 4 MOPS - Buffer Actividad  galactosidasa Concentración de ramnolípidos  g/ml

Expresión de rhlR y producción de ramnolípidos y producción de ramnolípidos de la cepa PAO1 en medio LB modificado LBLB +MOPS LBLB +MOPS 1.5 A 600nm Fase estacionaria tardía  g/ml Actividad  - galactosidasa Concentración de ramnolipidos Unidades miller

CONCLUSIONES I. El operón rhlAB se transcribe principalmente en fase estacionaria aún en presencia de RhlR y BHL desde la fase exponencial de crecimiento. Este silenciamiento de la expresión en fase exponencial puede estar relacionado con la respuesta astringente o con la presencia de algún represor. II. La expresión del promotor del gen rhlA es parcialmente dependiente del factor  s en tanto    no tiene un efecto directo en este proceso como había sido propuesto anteriormente. III. Existe una interacción directa y específica entre el regulador transcripcional RhlR y la región promotora de rhlA, la cual ocurre tanto con la proteína RhlR sola, como acomplejada con BHL. IV. La conformación tomada por RhlR varía dependiendo de si esta acoplado o no al autoinductor, como se manifiesta por las diferencias en la extensión que cubre del promotor de rhlA en estas dos condiciones. V. Cuando RhlR está acomplejado con BHL, funciona como un regulador positivo de rhlA, en tanto cuando no lo está funciona como un regulador negativo.

La región regulatoria de rhlR posee cuatro promotores, tres de los cuales muestran diferencias en su expresión dependiendo de la presencia de reguladores transcripcionales tales como LasR, Vfr, y RpoN que actuan como reguladores positivos, en tanto rhlR posee una autorregulación negativa por RhlR. La región promotora de rhlR presenta tres probables cajas las y una probable caja Vfr. La expresión de rhlR no solo depende de una alta densidad celular, sino de la composición del medio. Esta dependencia correlaciona con la existencia de una compleja estructura de su región promotora. La regulación de la expresión de rhlR muestra que es un punto importante en la respuesta del sistema detector de quórum a factores ambientales así como para la producción de ramnolípidos, sin embargo la presencia de RhlR no es suficiente para producirlos. VI. VII. VIII. IX.

Modelo de regulación de algunos factores de virulencia en P. aeruginosa, mostrando los dos sistemas detectores de quórum y otros reguladores importantes.

PERSPECTIVAS 1. Determinar cual es el factor responsable del “silenciamiento” en fase exponencial de la expresión de rhlAB. 2. Determinar cuales son las bases importantes de la caja las de rhlAB para la especificidad y afinidad por la proteína RhlR. 3. Demostrar que la caja VFR putativa encontrada en la región promotora de rhlR es en efecto una secuencia de pegado de esta proteína. 4. Determinar cual o cuales de las tres cajas las encontradas en la región promotora de rhlR son funcionales, así como determinar si son sitios de pegado de LasR, de RhlR o de ambos. 5. Medir la concentración de autoinductores en los sobrenadantes de los medios utilizados, para determinar si la síntesis de autoinductores es el factor limitante para la producción de ramnolípidos en algunas condiciones de cultivo.