Genes y moléculas con un papel emergente en la Insuficiencia Cardiaca Buenas tardes a todos. En 1º lugar quiero agradecerer a Drs su invitación. Es para mí un placer y un orgullo haber venido a este hospital y el poder olaborar con ellos y con los compañeros residentes.vamos a hablar de… orientados desde un pv práctico, ya que cómo se ha visto son miles los genes y moléculas que estarían implicados. Nuestar orientación se hará de acuerdo a aquellos que tienen un papel emergente y que son necesarios para comprender lo hasta ahora dicho,pero a un nivel subcelular. Miguel A. Torralba Servicio de Medicina HCU Lozano Blesa de Zaragoza

Aspectos a tratar Qué es un gen. Qué es una proteina. Genómica/Proteómica. Algunas moléculas recientemente implicadas en la Insuficiencia cardiaca. Hablaremos pues de qué es un gen y cómo trabaja, qué es una proteina y como se sintetiza para posteriormente reflexionar sobre el proyecto genoma y dar una pincelada sobre la proteómica. TODO ELLO CON EL OBJETIVO

Objetivos Conocer algunos de los mecanismos íntimos a un nivel molecular implicados en la Insuficiencia Cardiaca. De conocoer los mecanismos íntimamente implicados en la ICC A UN NIVEL MOLECULAR MUY BÁSICO, para sentar las bases para la COMPRENSIÓN DE LOS EVENTOS FUTUROS EN CUANTO A FISIOLOGÍA y TRTAº DE ICC Sentar las bases para la comprensión de los futuros tratamientos en IC.

Aspectos históricos KARY B. MULLIS: “PCR” Gregor Mendel:”leyes de la Herencia” A. Kossel: “Ácidos Nucleicos” Hershey y Chase: “ADN es material genético” Watson y Crick: “estructura doble hélice” <<aislamiento de 1º genes humanos>> Science: 1ª secuenciación genoma(SV40) KARY B. MULLIS: “PCR” Organización del Genoma Humano Genoma de Drosophila M. SECUENCIA GENOMA HUMANO 1866 1910 1950 1953 1975 1978 1986 1988 2000 2001

Concepto de Gen Un gen es la unidad básica de herencia de los seres vivos. Desde el punto de vista molecular, un gen es una secuencia lineal de nucleótidos en la molécula de ADN, que contiene la información necesaria para la síntesis de una macromolécula con función celular específica: Proteinas. ARN. VEAMOS CÓMO ACTÚA UN GEN Al conjunto de Genes de una especie se le denomina Genoma

TRANSCRIPCIÓN DEL DNA en RNA 1º TRANSCRIPCIÓN en RNA maduro TRANSLACIÓN EXPRESIÓN DE LOS GENES: Es el proceso mediante el cual la información contenida en los genes es utilizada para obtener las proteínas. Dos pasos son cruciales: la transcripción y la translación.  En la transcripción, una de las hebras del DNA es utilizada como molde para crear una molécula de m-RNA (RNA mensajero) [El RNA se diferencia del DNA en que contiene ribosa en lugar de deoxiribosa]. En la translación, la información contenida en el m-RNA es leída por la maquinaria sintética de la célula para crear la proteína.  En ambos procesos participan sofisticados mecanismos que permiten reconocer el inicio y el fin de la información, la polimerización del m-RNA, el transporte de los aminoácidos y su activación para formar la proteína, etc. La transcripción se inicia a partir de un iniciador situado en una zona no codificadora del gen (TATA) unos 30 nucleótidos antes. La polimerasa lee los nucleótidos de la cadena de DNA molde y contruye el RNA primario. TRANSCRIPCIÓN DEL RNA: En realidad, la situación es mucho más compleja, puesto que un gen se encuentra "partido" a lo largo del DNA en varios fragmentos separados por intrones. Tanto los intrones como los fragmentos con el código (exones) son transcritos como muestra la figura que esquematiza la transcripción del gen de la ovoalbúmina que, inicialmente, se extiende a lo largo de 7.700 pares de bases.  Bajo la acción de la polimerasa se produce el RNA primario que se estabiliza con la adición de una caperuza y cola de poli-A.  Seguidamente, bajo la acción de enzimas de restricción, los intrones son recortados y los axones pegados, formándose un RNA intermedio y finalmente un m-RNA maduro. En este caso, el m-RNA de la ovoalbúmina contiene 1872 pares de bases.  El proceso transcurre en el núcleo; en cuanto finaliza el m-RNA pasa al citoplasma.  TRANSLACIÓN: Una vez que el m-RNA maduro pasa al citoplasma, la información contenida es convertida en una proteína durante el proceso de translación. Este se inicia cuando unos factores de iniciación (iF1 ) y una fuente de energía, el GTP,  se unen a RNA de transferencia (t-RNA) del primer aminoacido que se incorporará a la proteína (suele ser la metionina). Al mismo tiempo, las dos subunidades ribosómicas se unen al m-RNA maduro formando un complejo con dos puntos de anclaje P y A. El primer aminoácido se fija en el punto de anclaje A y se liberan los factores de iniciación, mientras se hidroliza el GTP. El segundo aminoacido es conducido por su correspondiente t-RNA al punto de anclaje A. Se produce entonces la transferencia del primer aminoácido que se une al aminoácido entrante.  El primer t-RNA (ya vacío) se desprende y el segundo t-RNA con el péptido creciente se fija al anclaje P, mientras que el ribosoma se desplaza un codón y un nuevo t-RNA llega para anclarse a A.  La síntesis proteíca finaliza cuando un codón de terminaciòn del m-RNA (UAG) hace que el últmino t-RNA se hidrolice del ribosoma y  se separen las dos subunidades ribosómicas  Una vez producida la proteina esta debe de maduraR…

Una vez producida la proteina esta debe de maduraR… .. Y lo hace en el RE y en el aparto de Golgi donde es liberada la mayor parte de las veces por exocitosis como se ve en la película y va air a parar a la parte de la célula donde debe comenzar a trabajar.. LOS GENES son lo que nos hacen diferente a cada una de las especies animales, plantas, etc…

LOS GENES son lo que nos hacen diferente a cada una de las especies animales, plantas, etc… PERO ¿somos tan diferentes los hombres del retso de las especies….?

PERO ¿somos tan diferentes los hombres del retso de las especies….?

El Genoma humano 3000 millones de bp 26588 genes codificantes Sólo 1% del DNA se transcribe Organización en exones e intrones: SNPs: 1/1250 bp (2,1millones). Microsatélites. ESTs Science: 16 February 2001 (291). La respuesta es ¡¡¡¡NO!!! El genoma humano se compone de… (LEER DIAPO) Entonces ..¿qué es lo que nos diferencia? CAUSAS DE LA COMPLEJIDAD DEL GENOMA HUMANO: Un GEN es capaz de construir diferentes productos en un proceso que es llamado ayuste alternativo Existen miles de modificaciones químicas para fabricar proteínas así como del repertorio de mecanismos que regulan este proceso.

El Genoma humano Ajuste alternativo Genómica: es el estudio de los genes: estructura función Ajuste alternativo UN PROCESO IMPORTANTE que nos diferencia es la capacidad que han adquirido los genes humanos de producir muchas más proteinas con muy pocos genes más genes. UN EJEMPLO CLARO ES EL PROCESO DE AYUSTE ALTERNATIVO O SPLICING: 1 gen NO ES INGUAL A UNA PROTEINA EN LA MAYOR PARTE DE LAS VECES, SIN no que si bien existen 28000 genes se conocen más de 100000 proteinas y diariamente se están publicando nuevos hallazgos en este sentido. POR TANTO, es muy importante tener conocoimiento de genómioca pero… .. No sólo en cuanto a la estructura del gen si no también en la función de los mismos. Y el médico debe colaborar y asomarse al laboratorio y al tubo de ensayo para que exista una buena transmisión de información en ambos sentidos (del clínico al laboratorio y del laboratorio al clínico). Guttmacher A et al. N Engl J Med 2002; 34: 1512-20

Mecanismos por los que un Gen puede dar lugar a múltiples productos génicos TRANSCRIPCIÓN PROCESAMIENTO TRADUCCIÓN TRANSLACIÓN Proteolisis DNA RNA mRNA PROTEINA Modificación Post-transduccional Regulación transcripcional Procesamiento de Intrones. Edición de mRNA Poliadenilación Regulación tranduccional Compartimentalización Pero … además de la transcripción del RNA se pueden dar muchas otras modificaciones de los productos génicos por: -transcripción de 1 gen (estímulo vs inhibicón) Modulación del procesamiento del RNAm y Poliadenilación. O bien puede existir una regulación traduccional. O en el proceso de maduración de la proteina en el caso de que esto sea necesario. POR LO TANTO, SI BIEN ES MUY INTERESANTE EL ESTUDIO DE LOS GENES, lo realmente interesante es el estudio de la PROTEÓMICA: De expresión (dónde se expresa la proteina). Estructural (dónde cumple su función). Función. De expresión Proteómica: es el estudio a gran escala de los productos génicos de un Genoma Estructural Funcional

Genómica/proteómica e Insuficiencia Cardiaca Mecanismos por los que se llega a la IC: Hiperplasia. Fibrosis. Necrosis. Apoptosis. ¡PERO QUE TIENE TODO ESTO QUE VER CON LA IC? sI recordamos la espiral de violencia y el conjunto de fenómenos que se producen desde que se produce el insulto miocárdico hasta que se produce el remodelado VI, a este nivel existe un momento en que los factores neurohormonales aquí ya mencionados, lo que van a hacer es activar o inactivar genes con SUS CONSECUENCIAS. A fin de cuentas, los mecanismos por los que se IC son: Hiperplasia, fibrosis, necrosis y la apoptosis y TODO ELLO VIENE MEDIADO POR MECANISMOS DE TRADUCCIÓN DE SEÑALES QUE REGULAN LA EXPRESIÓN DE GENES. VEAMOS PUES, CUÁLES SON ESTOS MECANISMOS DE TRADUCCIÓN. TODO MEDIADO POR MECANISMOS DE TRADUCCIÓN DE SEÑALES QUE REGULAN LA EXPRESIÓN DE GENES

Adaptado de Harrison: principios de Medicina Interna 16ª Edición PROLIFERACIÓN CELULAR Angiotensina II Catecolaminas Endotelina TNF-a GH IGF Cardiotropina-I Estiramiento mecánico La transmisión de señales se lleva a cabo mediante mensajeros FIBROSIS Angiotensina II Endotelina Aldosterona TGF- b APOPTOSIS TNF-a Fas VEAMOS PUES, CUÁLES SON ESTOS MECANISMOS DE TRADUCCIÓN. ESTE ES EXACTAMENTE EL SITIO DONDE TERMINÉ LA CHARLA EL AÑO PASADO… Se nomraron los factores neurohorn¡monales (AGONISTAS) implicados y comentamos que traducián señales al interior de la célulal cuando se unían a su receptor y…a partir de aquí.. ¿QUÉ OCURRE? Pues a partir de aquí hablaremos de receptores, SEÑALES DE TRANSMISIÓN Y EFECTORES (GENES) FACTORES CONTRARREGULADORES ANP Bradicinina Óxido Nítrico BNP Adaptado de Harrison: principios de Medicina Interna 16ª Edición

La molécula fundamental en la transducción de señales extracelulares es el RECEPTOR EMPECEMOS HABLANDO DE RECEPTORES: en general los hay de 2 tipos. De membrana. Intracelulares.

Señalización asociada a RECEPTORES DE MEMBRANA RECEPTORES DE MEMBRANA: de 3 tipos: . Asociados a canales ionicos. . Rec eptores asociados a proteinas G . Receptores con actividad enzimática (suslen ser receptores con actividad Tirosin Kinasa, íntimamente relacionado con el cáncer) pero como se verá también muy relacionado con la IC ( La IC y el cáncer no son demasiado diferentes en algunos de los mecanismos moleculares implicados).

(I) RECEPTORES DE MEMBRANA ASOCIADOS A CANALES IÓNICOS EN Cuanto a los receptores asociados a canales ionicos, estos suslen precisar de un agonista que condiciona la modicficación de la estrcutura del canal de tal manera que la apertura del mismo permite la movilizsación de IONES. La Ryonina 2 sería una molécula de este tipo. Pertenece a los sistemas de membrana y está sutuada en el RE intimamenete relacionada con los canales de Ca tipo L. La Ryonina (Ry) es regulada por una proteina estabilizadora (calstabina 2)(FKBP12.6). EN DIASTOLE: la Calstabina se une a la Ry2 y mantiene el canal de Ca cerrado. Posteriormente el ESTÍMULO ADRENERGICO y la PROTEIN KINASA A ocasionan FOSFORILZACIÓN de la Ry2 de tal manera que la Calstabina 2 se desliga de la R2 y el canal se abre, pasando el Calcio que condiociona la ACTIVACIÓN DE LA CONTRACCIÓN.

(I) RECEPTORES DE MEMBRANA ASOCIADOS A CANALES IÓNICOS en la INSUFICIENCIA CARDIACA: La Rionina Farr et al. N Engl J Med 2004; 35: 185-87 Pero EN IC EXISTE UN AUMENTO DE estímulo hiperdarenergico que condiciona una hiperactivación de la LA protein kinasa A y una HIPERFOSFORILZACIÓN DE la Ry2 que como consecuencia traen que la Calsatbina 2 no puede unirse a dicha molécula condicionando un mal funcionamineto de dicho canmal que permanece abierto perdiendo calcio y que no se CIERRA BIEN EN LA DIASTOLE. Esto constituye una diana desde el pv terapéutico de tal manera que se están realizando ensayos en animales de experimentación donde el fármaco JTV519 hace que la Calstabina aumenete su afinidad por la Ry2 fosforilada. OTRO ASPECTO DE FUTURO ES EL USO DE AGONISTAS DE CALSTABINA2.

(II) RECEPTORES DE MEMBRANA ASOCIADOS A PROTEINAS G VÍA ADENILATO CICLASA EL 2º TIPO DE RECEPTOR FUNDAMENTAL SERÍA EL LIGADO A LAS PROTEINAS G Y ESTE ES DE 3 TIPOS FUNDAMENTALES: El que actua por la via de la ADENILATO CICLASA: acaba produciendo prtein kinasa a. 2. El que actua por medio de la GUANILATO CICLASA: 3. El que acaba actuando por medio de la FOSFOLIPASA. SÍNTESIS PROTEICA

(II) RECEPTORES DE MEMBRANA ASOCIADOS A PROTEINAS G El que acaba actuando por medio de la FOSFOLIPASA C: Necesita de 2º mensajeros hormonales como son el INOSITOL 3 P Y EL CALCIO. Por un lado se obtendra PK C con funciones de activación y/o inactivación de determinadas proteinas. Por otro lado se acaba liberando otro 2º mensajero hormonal como es el Calcio, para producir calmodlina, INTIMAMENTE RELACIONADA cn la activación /inactivación de la NO sintasa. Calmodulina Kinasa NO sintasa VÍA FOSFOLIPASA C Protein Kinasa C

(II) RECEPTORES DE MEMBRANA ASOCIADOS A PROTEINAS G VÍA GUANILATO CICLASA El último gran tipo de recpetor asociado a PROTEINAS G sería el que actuaría por medio del GTP. Se activaría la protein kinasa G con funciones de activació de genes implicados en la sintesis proteica. Protein Kinasa G SÍNTESIS PROTEICA

(II) RECEPTORES DE MEMBRANA ASOCIADOS A PROTEINAS G EN LA INSUFICIENCIA CARDIACA: el Receptor B1 RECEPTOR B1: aumenta contractilidad e HVI mediante Adenilato ciclasa. Un ejemplo de este tipo de receptor es el Receptor beta 1 que actua por medio de la ADENILATO CICLASA. LA ADENILATO CICLASA no solo hiperfosforila el fosfoilamban sino la Ry2, intimamente implicados con la alteración de la relajación del miocito durante la diastole. ¿HAN PENSADO VDS LO QUE HACEN CUANDO INHIBEN UN RECEPTOR ALFA Y BETA? Hunter J et al. N Engl J Med 1999; 341: 1276-83

(III) RECEPTORES DE MEMBRANA CON ACTIVIDAD TIROSIN KINASA (TKr) El TERCER TIPO DE RECEPTOR SERÍA AQUEL QUE ACTIVA LAS TIROSINKINASAS. Las Tirosin Kinasas suselen estar inactivadas y reciben el estímulo del agosnista de tal manera que se activan por el mismo. Se produce una Hiperfosforilación y transmiten señales al interior de la célula mediante 2 váis principales: El Inositol 3P: que acaba condionando la producción de energía en forma de Glucosa. La vía de la Mitogen activated Kinasa Protein. La consecuencia final es la MITOSIS CELULAR y la Hipertrofia. Esto está altamente implicado en el cancer, pero recientemente se ha descubierto que el miocito tb puede seguir esta vía

(III) RECEPTORES DE MEMBRANA CON ACTIVIDAD TIROSIN KINASA (TKr) EN LA INSUF CARDIACA: el Receptor ErbB2 Recpetores con actividad Tirosin Kinasa como el ErbB2 están altamente implicados en señales que condicionan la aparición de IC por medio de su expresión. Esto se ha visto cuando en algunos animales de experimentación se utilizaba la Herceptina (TRASTUZUMAB) que bloquea a dicho receptor del tipo tirosin kinasa. ESTO REPRESENTA UNA NUEVA VÍA DE INVESTIGACIÓN EN IC. Kenneth R et al. N Engl J Med 2006; 354: 789-90

Moleculas y genes implicados: ¿NOS HEMOS PLANTEADO QUÉ HACEMOS CUANDO SE UTILIZAN LOS ALFA-BETA BLOQUEANTES? Moleculas y genes implicados: B1 y B2: aumentan contractilidad e HVI mediante Adenilato ciclasa. B2: activa la protein kinasa mitógena y contrarregulación. B3: activa la NO sintasa. a1 postsinapsis: activa la protein kinasa mitógena->HVI. a2 presinapsis: regulación de la liberación de Noradrenalina. EN CONSECUENCIA…..¿HEMOS PENSADO ALGUNA VEZ TODO LO QUE HACEMOS CUANDO DAMOS UN ALFABLOQUEANTE A UN PACIENTE CON IC? Hayar RJ et al. N Engl J Med 2002; 347: 1196-1199

Hasta aquí muy bien, pero...¿cuáles son los genes activados?

¿CUÁLES SON LOS GENES QUE SE TRANSCRIBEN POR ESTOS MECANISMOS? Pro-BNP, pro-ANP. Codificantes estructuras sarcoméricas: MYH6, MYH10. Implicados en la Apoptosis: CCL2, PHLDA1, SNCA. Implicados en el Crecimiento celular: FRZB, SFRP4, SPOCK, CTFG. Implicados en el control del Ciclo celular: G0S2, ETV5, RARRES1. Genes implicados en la Respuesta Inmune: CFHL3, FCN3, CCL2, S100A8. LEER… BARTH 40 MUESTRAS DE MIOCARDIO de distintos pacientes con MCPD y realizan estudio funcional de genes (expresión) ¿Y COMO SABEMOS NOSOTROS ESTO? Barth A et al. JACC 2006; 48: 1610-17

Los microarrays EN 40 MUESTRAS DE MIOCARDIO Sauter, G. et al. N Engl J Med 2002;347:1995-1996 Edison T. et al. N Engl J Med 2004;350:1595-1596

…¿ y no les vas a contar eso tan bonito que apareció el martes en una revista?...

Se comprueba mediante microarrays el valor de un fármaco para MICROARRAYS FUNCIONALES Se comprueba mediante microarrays el valor de un fármaco para inhibir o expresar un gen en una determinada enfermedad Gullans SR. N Engl J Med 2006;November 9: 2042-44

¿Qué nos deparará el futuro? Hunter J et al. N Engl J Med 1999; 341: 1276-83

BE A GEN MY FRIEND …piensa en genes… …SÉ UN GEN …que se expresan… AMIGO MÍO …que se expresan… …en el núcleo… Vacía tu mente…. …si una célula recibe una señal de alarma… …siempre habrá un gen que responderá… …un gen puede expresarse o puede inhibirse…

<<Ninguna oportunidad u obligación mayores le hubiese tocado en suerte a un ser humano que la de ser médico. Al cuidar a los que sufren necesita pericia técnica, conocimientos científicos y comprensión humana. Quien realiza su tarea con valor, humildad y sabiduría, presta un servicio insustituible a su hermano el hombre y así elevará un edificio perdurable en los más íntimo de su ser>> Tinsley R Harrison

¿Qué nos deparará el futuro? Kinasas – calstabina RADIONINA R1 Y R2 Tamargo J. Rev Esp Cardiol 2004; 57: 447-64