“BIOLOGÍA MOLECULAR: Herramienta de la Biotecnología” Fac. de CCNN y Matemática (UES) PROGRAMA DE JÓVENES TALENTO “BIOLOGÍA MOLECULAR: Herramienta de la Biotecnología” JOSÉ ROBERTO ALEGRÍA COTO Depto. de Desarrollo Científico y Tecnológico ralegria@conacyt.gob.sv Centro Escolar Doroteo Vasconcelos Ayutuxtepeque, San Salvador. .

CONTENIDO: Objetivos Historia de la Biología Molecular La Biología Molecular: herramienta de la Biotecnología Tecnología del ADN Ingeniería Genética Marcadores Reflexión Final

OBJETIVOS: Estimular el interés de los jóvenes hacia la Biología Molecular y sus aplicaciones en la Biotecnología. . Promover en los educandos el espíritu crítico hacia el potencial de la investigación biotecnológica para el desarrollo de la humanidad. Presentar elementos de juicio que permitan comprender la importancia de la investigación en biología molecular.

AVANCES HISTÓRICOS DE BIOLOGÍA MOLECULAR 1941 Genes codifican las proteínas 1944 Prueba que el ADN porta la información genética 1953 Determinación de estructura del ADN y de la Insulina 1956 Enfermedad monogénica sustitución de un aa cadena β-hemoglobina 1961 Código Genético, ARN mensajero, regulación génica 1967 Wise y Richardson aislaron ADN ligasa 1970 Smith y colegas aislaron y caracterizaron la Hind III 1972 Janet Mertz y Ron Davis cortaron y pegaron mol de ADN 1973 Stanley Cohen y H. Boyer pusieron ADNr en bacterias 1974 Demostración directa de delección génica humana 1975 Southern Blotting 1976 Proto-oncogenes 1977 Fred Sanger secuenció el virus de ADN Ф X174 1978 Biblioteca génica humana 1979 RFPL para diagnóstico prenatal, oncogenes celulares

AVANCES HISTÓRICOS DE BIOLOGÍA MOLECULAR 1979-81 genes humanos clonados y secuenciados 1982 Tabaco, la primera planta modificada genéticamente 1983 Kary Mullis concibe el PCR / Fred Sanger y colegas publican la secuencia del λ lambda 1985 Un “gen de enfermedad” aislado por clonación posicional 1986 La secuenciación del ADN es automatizada 1987 Inicia el Proyecto del Genoma Humano 1995 Es secuenciado la bacteria Haemophillus influenzae 1996 Es secuenciada la levadura Saccharomyces cerevisiae 1998 Es secuenciado el nemátodo Caenorhabditis elegans 1999 Es secuenciado el cromosoma 22 humano 2000 Es secuenciada la mosca de la fruta D. melanogaster / 26 de junio se presenta 90% borrador genoma humano 2001 Feb 2001 se completa el genoma humano.

BASES MOLECULARES DE LA VIDA ADN ADN ARN PROTEÍNAS genoma Célula cromosomas genes los genes contienen instrucciones para hacer proteínas ADN las proteínas actúan solas o en complejos para realizar las funciones celulares BASES MOLECULARES DE LA VIDA ADN ADN ARN PROTEÍNAS

BIOTECNOLOGÍA Es el medio o vía de manipulación de las formas de vida (organismos) para proveer un producto deseable para el uso del hombre. Areas cubiertas por el término Biotecnología incluyen: i) Biología Molecular: ADN recombinante, cultivo de células animales, cultivo de tejidos vegetales, inmunología, mejoramiento animal y vegetal, ii) Fermentación, iii) Sistema de Enzimas y iv) Otras.

Anticuerpos Monoclonales . Marcadores Ingeniería Genética Tecnología del ADN Fármacos Anti-cáncer Diagnósticos Cultivo de Células Vegetales Transferencia de genes en animales Síntesis de Sondas de ADN Localización desórdenes genéticos Clonación Solución de crimenes BIOTECNOLOGÍA Producción de Proteínas humanas Terapia Génica Bancos de ADN, ARN Proteínas Mapas de Genomas completos Biología Molecular Cultivos Celulares Anticuerpos Monoclonales Síntesis de Nuevas Proteínas Nuevos Antibióticos Nuevas Plantas y Animales Alimentos Recursos humanos químicos raros BIOTECNOLOGÍA

Tecnología del ADN (Diagnóstico Molecular) PCR - REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA El PCR utiliza la capacidad de las Enzimas polimerasas que catalizan la formación y reparación de ADN (y ARN), mediante un mecanismo que permite iniciar y parar su actividad en un punto específico de una hebra de ADN, para lo cual se emplean polimerasas obtenidas de arqueobacterias como Termophillus aquaticus que resisten temperaturas arriba de los 100°C. Kary B. Mullis, de Cetus Corporation que concibió el mecanismo del PCR, en la década de los 80,s recibió el Premio Nobel en 1993.

Tecnología del ADN FINGERPRINTING El ADN tiene muchas regiones que son muy variables en su estructura (RFLPs) y pueden ser usadas para ADN fingerprintings. El ADN puede ser obtenido de sangre, fluidos corporales y otros tejidos incluyendo hueso, y es relativamente estable, frecuentemente sobre muchos años. Se requieren cantidades muy pequeñas y las muestras pueden ser obtenidas de manera no invasiva.

Tecnología del ADN (identificación de paternidad) MADRE PADRE NIÑO 1 NIÑO 2 NIÑO 3 NIÑO 4

Tecnología del ADN BIOINFORMÁTICA Campo convergente de la biología, computación e información tecnológica en una misma disciplina. La meta última de este campo es posibilitar el descubrimiento de nuevas ideas biológicas, así como crear una perspectiva global de la que puedan ser discernidos principios unificadores de la biología (www.ncbi.nlm.nih.gov/Education/index.html).

GENÓMICA Es el estudio del genoma y su acción. Tecnología del ADN El genoma es la suma total del material genético presente en un organismo particular e incluye el ADN presente en los cromosomas y en los organelos subcelulares (ej., mitocondrias) e incluye el genoma de ARN de algunos virus. El anuncio el 26 de junio de 2000, del borrador del genoma humano en un 90%, marcó un hito histórico para la humanidad.

GENOMAS Tecnología del ADN IDENTIDAD GENÉTICA El genoma de un organismo es el juego completo de ADN. La planificación del Proyecto Genoma Humano se inició en 1986, previsto para el 2007. En Junio de 2000 se presentó el 90% del borrador con la secuenciación de unos 30,000 genes y 3 mil millones de pares de bases (pb). Los genes son secuencias específicas de bases que codifican instrucciones para hacer proteínas. Los genes son un 2% del genoma humano. Entre una persona y otra el ADN solo difiere en 0.2% 60% IDENTIDAD GENÉTICA De 289 genes humanos implicados en enfermedades, hay 177 cercanamente similares a los genes de Drosophila. 20% 70% 95% idéntico Humanos 30,000 genes Chimpancé 30,000 genes Ratón 30,000 genes A. thaliana 25,000 genes C. elegans 19,000 genes D. melanogaster 13,000 genes

Leer 3 mil M de bases. Si el sistema se logra GENÓMICA FUTURA 14th International Genome Secuencing and Analysis Conference (oct. 2002), la US Genomics Inc., presentó un aparato que lee la doble hélice de ADN sin cortarlo. Abre la doble hélice espiral de ADN, la lineariza y la pasa por un escaner para leerla en un lector fijo (como una pélicula de carrete pasa por un proyector), las moléculas se mueven a 30 M de bases por minuto. En 40 minutos se pueden Leer 3 mil M de bases. Si el sistema se logra pasar a un biochip el tiempo bajará a menos de cinco minutos por la habilidad de capturar un Terabyte (1024 o 1000 gigabites, un gigabite = 1024 o 1000 Megabites) de información cada pocos segundos.(Uehling, M. D, Bio-It World Nov. 12 2002).

PROTEÓMICA Tecnología del ADN La Proteómica es la “caracterización sistemática a gran escala de las proteínas presentes en una célula, tejido u organismo”. Es una disciplina en su infancia limitada por la tecnología disponible para quienes la practican. Este es un diferente paradigma del reduccionismo convencional de la investigación científica que típicamente se enfoca en un simple gen o una proteína; en tanto, que la investigación del Proteoma (conjunto de todas las proteínas que intervienen en los procesos biológicos de una especie) aborda problemas tales como el nivel de proteínas o actividades que cambian entre dos condiciones experimentales (Spelcher, 2002. The Scientist 16(8): 12, Apr. 15).

DISCIPLINAS “ÓMICAS” Tecnología del ADN Está ocurriendo la transición de décadas de biología reduccionista, enfocadas a un gen o a una proteína, por utilización de las nuevas disciplinas “omicas” que incluyen: Transcriptómica (espectro de moléculas de ARN en cada célula tipo), Metabolómica (todos los químicos en la célula), Fisiómica (función de órganos, tejidos y ultimadamente el organismo completo). Crítico para el éxito de esta revolución es la bioinformática y nuevas estrategias de computación, para modelar las propiedades de células, órganos y estados de enfermedad, produciendo órganos y pacientes virtuales (Goldman, M., Bio-It World Nov.24 2002).

INGENIERÍA GENÉTICA O ADNr La Ingeniería Genética o tecnología del ADNr se inició en la década de los 70s. Se refiere a un grupo de tecnologías usadas para cambiar la composición genética de las células y mover genes a través de las fronteras de las especies para producir nuevos organismos. Se pueden aislar genes, modificarlos, introducirlos a nuevos hospederos, y clonarlos para obtener una ventaja novedosa sobre el organismo natural.

ESTRUCTURA DE UN GEN < 100 Kb Promotores Exones Sitio de inicio de la Transcripción Sitio de terminación de la Transcripción Realzadores < 100 Kb Los promotores pueden ser genéricos o tejido específico La función del gen depende de los FACTORES de TRANSCRIPCIÓN (FT) que activan a las ARN pol. Los FT son: los Factores de Transcripción General (se unen a secuencias promotoras genéricas) y los Activadores de Transcripción (se unen a secuencias promotoras específicas). Los FT pueden encenderse o apagarse en respuesta a estímulos del entorno del individuo. Entre los promotores de los genes que desarrollan la capacidad cerebral o talento de los individuos están la alimentación, la salud, el estímulo temprano con experiencias motivadoras (el juego), el amor. Intrones

Ingeniería Genética SISTEMAS DE TRANSFERENCIA GENÉTICA 1. Agrobacterium. Uso de la bacteria Como "Ingeniero Genético". La bacteria conteniendo el inserto, infecta las células de la planta produciendo la recombinación genética. 2. Acelerador de Partículas (Gene Gun). Un cañón artificial bombardea micropartículas con el inserto, sobre la célula. 3. Electroporación. Uso de carga eléctrica para que el ADN atraviese la membrana nuclear. 4. Polietilenglicol. Exposición de las membranas al PEG, facilita el movimiento de las moléculas de ADN. 5. Silicon Wiskers. Inyección con fibras microscópi-cas, que atraviesan las membranas con los insertos.

Ingeniería Genética NUEVAS PROTEÍNAS Enzimas producidas por Biotecnología mediante el ADN recombinante se usan como aditivos en dietas de aves, para digerir carbohidratos complejos como las beta-glucanasas, alfa-amilasas, maltasas, oligo 1-6 glucosidasas, xilanasas, sacarasas; lipasas; proteasas y fitasas (para la utilización del fósforo). En México, tienen un gran impacto en la producción avícola proporcionando 3/5 de carne de aves para el consumo de proteína animal. Se considera que el mercado mundial de enzimas como aditivos en los alimentos crecerá del valor actual de US $ 60 millones al doble para el 2005. (Avila G., E. Huatulco 2001).

Ingeniería Genética NUEVAS PLANTAS ARROZ con altos niveles de tolerancia a diferentes condiciones ambientales de estrés. Se insertaron dos genes fusionados de trehalosa de E. Coli y un promotor tejido específico dependiente del estrés. Los genes de trehalosa permiten la producción de arroz aún si está estresado por frio, sequía o altos niveles de salinidad e incrementa la producción en 20%. La composición química de los granos no cambia. El azúcar trehalosa ayuda a estabilizar moléculas biológicas: lípidos, enzimas y otras proteínas, en organismos en condiciones de estrés (PNAS Online, 27 nov. 2002).

Ingeniería Genética NUEVOS ANIMALES 1987 secreción de Beta-lactoglobulina en leche de ratón. Producción de proteína C humana en leche de cerdos, para desórdenes como hemofilia. Hormonas de crecimiento humano en tejido seminal de cerdo. Antitrombina humana III, anti- coagulante sanguíneo secretada en leche de cabras transgénicas. Cabras transgénicas para producir BioSteel fibra hecha por el hombre con propiedades de tela de araña.

Ingeniería Genética NUEVOS ALIMENTOS ARROZ DORADO con beta caroteno de genes de narciso y de Erwinia uredovora, pigmentos que se transforman en pro-vitamina A al ser ingeridos. Hay 70 patentes implicadas en la consecución del arroz dorado; acuerdo con la industria reducen a 12 las patentes esenciales y se limita su cultivo gratuito a las explotaciones agrícolas que no superen los 10.000 dólares de beneficios anuales (Gebelli, 2001). ARROZ fortificado con un gen de la ferritina del frijol de soya. ARROZ con aa esenciales.

Salmón transgénico por Ingeniería Genética NUEVOS ALIMENTOS Salmón transgénico por hormona de crecimiento. Producido por AF Protein Inc. Cuenta con el promotor de la proteína de anticongelamiento de otra especie de pez. Crece de 4 a 6 veces más rápido que un salmón no transgénico. Tiene un 20% en mejoramiento de la eficiencia de conversión del alimento. Cerdo transgénico para el precursor de la hormona de crecimiento proteasa resistente (GHRH). Por técnicas de mutagénesis sitio dirigida y terapia electrogénica, se introdujo en músculo de cerdo. Los efectos de una inyección de 10 mg de dosis del plásmido, en cerdos de tres semanas de edad, se mantuvo sobre 60 días con un 42% mayor que los controles a los 62 días (42 kg contra 29 kg). (ISB, 2000 mar). (ISB, 2001, oct; Netlink, 2000).

Ingeniería Genética NUEVOS ANTIBIÓTICOS PAPA con la vacuna que previene la insulina dependencia de la diabetes mellitus 100 veces más poderosa que la actual vacuna. PAPA con la sub-unidad B antigénica de la enterotoxina del Vibrio cholerae causante del cólera). FRIJOL de SOYA con anticuerpos que protegen contra el virus 2 de Herpes simplex (HSV). TABACO con anticuerpos que previenen la caries dental producida por Streptococcus mutans.

CLONACION Ingeniería Genética Término genérico para la replicación en un laboratorio de genes, células u organismos de una entidad original, con copias genéticas exactas del gen, célula u organismo original. Esta técnica ha producido avances sensacionales en medicinas y vacunas. También hay investigación en clonación de células humanas, órganos y otros tejidos. Esto puede producir el reemplazo de piel, cartilagos y hueso para victimas de quemaduras y accidentes, o de órganos.

TERAPIA DE CÉLULAS MADRE Ingeniería Genética TERAPIA DE CÉLULAS MADRE

Ingeniería Genética TERAPIA GÉNICA Rafael Valdes del Hospital de Niños de México Implantó células de cerdo en 12 adolescentes en procura de curar su diabetes. En su método, usó células especializadas para proteger el transplante de los sistemas inmunológicos de los pacientes hospederos, que nunca había sido ensayado en humanos. Los implantes en los pacientes constan de células pancreáticas de cerdo, las cuales producen insulina (hay 150 millones de diabéticos en el mundo) . Para prevenir el rechazo del transplante implantó células de Sertoli (de testículo de cerdo) que han mostrado que protegen a los tejidos transplantados del sistema inmune recipiente en algunos modelos animales. Uno de los pacientes ha dejado de inyectarse insulina y cinco otros están tomando menos insulina que antes. Los resultados han llegado sin usar medicamentos Inmuno- supresores, los cuales tienen que ser dados por el resto de sus vidas a recipientes de transplantes (Nature/Vol. 419/5 sept. 2002).

Marcadores SONDAS DE ADN El microarreglo de ADN pone secuencias de genes en una lámina. Los ARNm de una célula particular con “tags” fluorescentes, se hibridizan, a las secuencias cuando son complementarias. Un escáner mide la fluorescencia de cada muestra sobre la lámina, para determinar la presencia o actividad de los genes. COMPAÑÍA PRODUCTO GENES CARACTERÍSTICAS Affimetrix GeneChip Human Genoma + 12000 GeneChip Human Cancer + 1700 Selección de investigadores GeneChip Custom Arrays + 12000 Arreglos diseñados por clientes MBG Biotech Pan Human array 30000 Genes humanos en 3 slides Clontech Atlas Human 1.0 1081 Atlas Human Apoptosis array 205 Atlas Human Cardiovas array 588 Atlas Human Neurobiol array Atlas Human Oncogene array

CONSECUENCIAS CLÍNICAS Marcadores LOCALIZACIÓN DESORDENES GENÉTICOS GEN DROGA CONSECUENCIAS CLÍNICAS NAT-2 Isoniazida, hidralazina, procainamida, sulfonamidas Neuropatía, lupus eritomatoso CYP2D6 β bloqueadores antidepresivos, codeína, debrisoquina, antisicóticos, muchos otros Arritmias, disquinecia con antisicóticos, efectos narcóticos, cambios en eficacia, muchos otros CYP2C9 Tolbutamida, feniltoina, anti inflamatorios no esteroideos Efectos anticoagulantes modificados de warfarin RYR-1 Halotano y otros anestésicos Hipertermia maligna G6PD Primaquina, sulfonamidas, acetanilida, otros Anemia hemolítica ACE Captopril, enalapril Modif. respuesta a tratamiento de falla cardíaca, hipertensión, enfermedad renal HERG Quinadina Arritmia cardíaca (síndrome QT largo) HKCNE2 Claritromicina Arritmia inducida por droga

FUTURO NANOTECNOLÓGICO Marcadores FUTURO NANOTECNOLÓGICO Shumin Nie y sus colegas desarrollaron un cristal superconductor a escala nanométrica llamado punto cuántico (diez nanómetros es un diámetro 1000 veces menor que el grosor de un cabello humano). Las nanopartículas que usa pueden brillar en un espectro de seis colores visibles y cuatro infrarrojos. Variando su tamaño ligeramente, se puede hacer que brillen en uno de los 10 colores disponibles. En un futuro próximo, podrán ser enlazadas a fármacos médicos o agentes terapéuticos para identificar y tratar células cancerosas. Una vez detectadas estas últimas, podrían actuar como "bombas inteligentes", liberando una cantidad controlada de medicamento que sea apropiado para cada tipo particular de célula (Bowie, L. Georgia Institute Technology, oct. 23 2002).

REFLEXIONES El que investiga genera nuevos CONOCIMIENTOS, que pone a disposición de otros como DATOS, que al ordenarse son INFORMACIÓN, que puede llegar a ser CONOCIMIENTO útil, apropiado o adaptado, por la infraestructura de investigación de C&T que posea un país.

REFLEXIONES La incidencia positiva que las actividades de I+D tienen sobre el desarrollo de los países ha conducido a los gobiernos de los diferentes estados a destinar una parte de sus recursos financieros a potenciar ambas actividades. De esta manera ha sido posible diversificar las líneas de investigación con la finalidad de abarcar cada vez más campos y, al mismo tiempo, asegurar la formación de personal cualificado. CHINA, actualmente a la vanguardia en el desarrollo científico y tecnológico mundial, fundamentó en 1980 su productividad y competitividad, mediante Políticas de Ciencia y Tecnología, que formó miles de Ph.D. en todas las disciplinas de la C&T, en las más prestigiosas Universidades del mundo. CHILE, país al que imitamos constantemente, ejecuta la estrategia de las tres (C) COPIAR, COMPRAR, CREAR, para lo cual cuenta con recurso humano calificado.

Es de urgencia para el país apostarle a una Política de REFLEXIONES Es de urgencia para el país apostarle a una Política de Nación de Ciencia y de Tecnología, que identifique los nichos de conocimiento a ocupar, y promueva la adquisición de infraestructura necesaria y la formación de recursos humanos con capacidad de investigar, desarrollar y aprovechar tecnologías que ayuden a mejorar la calidad de vida de los salvadoreños.

¡MUCHAS GRACIAS POR SU ATENCION¡ www.conacyt.gob.sv ¡MUCHAS GRACIAS POR SU ATENCION¡ llamado punto cuántico BIENVENIDAS SUS PARTICIPACIONES Atentamente: ROBERTO ALEGRIA ralegria@conacyt.gob.sv