Universidad Interamericana de Puerto Rico, Recinto de Bayamon Regulación de la Expresión Genética Mediante RNA: Interferencia por RNA (RNA Interference), Ribozimas y Aptámeros Oscar N. Ruiz, Ph.D. Curso: BIOT 3250 Universidad Interamericana de Puerto Rico, Recinto de Bayamon

A. Objetivos Entender los mecanismos de silenciamiento y regulación de genes controlados por RNA. Comprender los conceptos que permiten la aplicación de la regulación mediante RNA a la biotecnología moderna. Aplicar los conceptos de la regulación de expresión mediante RNA para el desarrollo de agentes terapéuticos.

B. Conceptos Previos Transcripción Promotor y Terminador Estructura secundaria del RNA Modificaciones Post-transcripcionales RNA Splicing : separacion del RNA RNA Editing: cambios de nucleotidos para favorecer codones abundantes Regulacion de la expression: Eucariota: transcripcional, post-transcripcional y traduccional Procariota: transcripcional

C. Pertinencia del Tema Nuevas terapias son requeridas para contrarrestar: Enfermedades bacterianas MRSA: “methicillin-resistant S. aureus” (www.cdc.gov) Enfermedades virales VIH: Retrovirales (inhibidores de proteasa y inhibidores de retro-transcripción) Fiebre aviar (Avian Flu) Enfermedades genéticas Cáncer: gen p53 (Brummelkamp et al., 2002) Desarrollo de organismos modelos Estudios de función de los genes mediante “gene knockdown”

RNAi es un mecanismo conservado en eucariotas: D. Marco Conceptual Interferencia por RNA o RNA interference (RNAi): la inhibición especifica de la expresión de genes mediante dsRNA (Fire, 1999). RNAi es un mecanismo conservado en eucariotas: Protege contra: RNAs exogenos: viruses Transposones: elementos móviles y repetitivos Regulación post-transcripcional Genes del desarrollo

Aplicaciones biotecnológicas: Permite el análisis proteomico a gran escala Se está convirtiendo en una tecnología muy prometedora para el desarrollo de agentes terapéuticos (Santel et al., 2006) . Gran especificidad Bajos efectos secundarios No se conoce resistencia Desarrollo de organismos modelos para enfermedades humanas.

RNAi en la Célula Shi et al., 2002

Mecanismo del RNAi En animales RNAi requiere múltiples pasos: Generación de siRNAs a partir de dsRNAs largos Rnase III-like endonuclease (Dicer) Degradación de RNA complementario mediante el complejo siRNA-RISC (RNA-induced silencing complex) (Hannon, 2002). www.rnaiweb.com/RNAi/What_is_RNAi

El mecanismo de RNAi es bien conservado pero con características diferentes en cada organismo: C. elegans: ocurre la amplificación y conversión de ssRNA a dsRNA RNA-dependent RNA polymerase Este dsRNA es substrato para mas RNAi mediante (Ahlquist, 2002). C. elegans: se ha observado el esparcimiento de RNAi de una célula a otra: Efecto sistémico Transportador específico de siRNA en la membrana celular (Winston et al., 2002). ORFs similares a los de C. elengans en humanos y en ratones pero . park.itc.u-tokyo.ac.jp/mgrl/IINO_lab/g2_molgenet2.html

RNA polimerasa dependiente de RNA “RNA-dependent RNA polymerase”

Acumulación de dsRNA (Brummelkamp et al., 2002). En C. elegans and Drosophila: siRNA se deriva de dsRNA largos. En las células mamíferas: dsRNA mayores de 29 nt producen la activación de la “dsRNA-dependent protein kinase (PKR)” (Stark et al., 1998; Schiffelers et al., 2004) Produce la inhibición generalizada de la transducción e induce a la apoptosis (Gil, 2000). Dicer tiene baja actividad en el procesamiento de dsRNA largos in vivo Acumulación de dsRNA (Brummelkamp et al., 2002). Activa la respuesta tipo 1 mediada por inteferón “STAT-mediated expression of PKR”. signal transducer and activator of transcription 1 (91kDa) dsRNA se une a PKR directamente y la activa Ocurre fosforilacion del factor de iniciación eucariota (global shutdown of translation). dsRNA promueve la síntesis de acido poliadenílico “polyadenylic acid” Activa a Rnase L http://www.ambion.com/techlib/resources/RNAi/

fig.cox.miami.edu/~cmallery/.../how_siRNA_works.htm www.biovalley.fr/francais/.../collec_shrna_pour_rnai.htm

Estatus de la Tecnología Producción de siRNA por síntesis química Beneficios: Muy específicos Síntesis a gran escala es posible Problemas: Se necesita suplir el siRNA de forma continua Su síntesis es costosa Se necesitan con alta pureza y concentración estudios in vivo necesitan altas concentraciones. Es necesaria la utilización de lisosomas y compuestos poli-cationicos para envío.

Producción de siRNA mediante vectores plásmidos: Se Pueden utilizar el promotor de la RNA polimerasa III: contiene todos los elementos de transcripción contenidos de forma compact La RNA polimerasa III esta envuelta en la producción de micro-RNA celulares y produce una extensión de 2 nt. Permite expresión por periodos mas prolongados Alta expresión y costos mas bajos

Problemas: Expresión temporera del siRNA Eficiencia de la transfección es muy baja especialmente in vivo.

Para resolver algunos de los problemas encontrados se han utilizado vectores virales incluyendo: retroviruses, lentiviruses, and adeno-associated viruses: Herramienta muy efectiva para la producción de siRNAs en células (Brummelkamp et al., 2002; Haasnoot et al., 2004; Zhang et al., 2004) Expresión estable y constitutiva Alta transferencia del transgene

Desventajas: Retroviruses han causado efectos adversos en estudios clínicos. Limita la aplicación de este sistema y otros sistemas de integración al azar como métodos de expresión de siRNA en el futuro cercano (Recchia et al., 2006). Posibilidad de contaminación con virus viables. Capacidad limitada para utilización in vivo en humanos: Tropismo del virus es limitado Es trabajoso seleccionar las células transfectadas.

Enfermedades humanas en estado avanzado requieren expresión del siRNA en múltiples tejidos o en el cuerpo completo. De manera alternativa, se podría inyectar siRNA sintetizados in vitro o químicamente cubiertos por liposomas (Santel et al., 2006). Mas seguro Requiere altas concentraciones del siRNA Es muy costoso

G. Resumen La tecnología del RNAi ha demostrado gran potencial RNAi in vitro and in vivo (Fraser et al., 2000; Lewis et al., 2002) Grandes aplicaciones terapéuticas RNAi ha logrado la reducción de la expresión de proteínas en sobre un 90%. Múltiples genes han logrado ser silenciados: Genes reporteros Genes virales (HIV proteins vif, nef and LTRs) Oncogenes (p53)

Problemas que limitan el uso de RNAi como agentes terapéuticos en humanos: (Uprichard 2005). Mecanismos de envío siRNA (small interference RNA) de tamaño específico 19-23 nt Efecto transitorio Síntesis costosa

D. Marco Conceptual: Aptámero Oligonucleótidos de RNA o DNA que producen estructuras secundarias tridimensionales con especificidad por otras moléculas SELEX: Evolución sistemática de ligándos por enriquecimiento exponencial “Systematic evolution of ligand by exponential enrichment” Biblioteca de 1 x1014-1015 http://www.devicelink.com/ivdt/archive/07/05/010.html

E. Ventajas y Aplicaciones Macugen (OSI Pharmaceuticals): aptamero inhibe el “antivascular endothelial growth factor” que participa en el crecimiento de vasos sanguíneos en el ojo. Aprobado por el FDA para tratar degeneración macular neovascular. ARC183 (Gilead) : aptamero anti-trombina que inhibe la coagulación fisiológica de la sangre. Aprobado en fase clínica I

Riboenzimas “Ribozymes” Riboenzimas: RNA con capacidad catalítica que cortan otras moléculas de RNA. Cortan su propia secuencia Cortan secuencias en otros RNA Muchas contienen Mg+2 como cofactor Dos regiones: Catalítica Secuencia de reconocimiento Pley, H.W., Flaherty, K.M. and McKay, D.B. (1994) Three-Dimensional Structure of a Hammerhead Ribozyme. Nature 372, 68-74.

E. Aplicaciones Ribozima anti-hepatitis B (Penn State College of Medicine): Destruye hasta el 80% del virus en el hígado del ratón. Es el único mecanismo in vivo que ha demostrado la reducción del virus de la hepatitis B.