WORLD INTELLECTUAL PROPERTY ORGANIZATION Procedimiento para la recuperación de Cefalexina MEMORIA DESCRIPTIVA WO 96/23796 BOESTEN WHJ, ROOS EC, VAN DEN TWEEL WJJ 1996 M. Oreamuno y R. Sancho.

Cefalexina La cefalexina es un antibiótico (Cefalosporina de 1era generación) usado para tratar ciertas infecciones bacterianas como la neumonía y las infecciones a los huesos, la piel, el oído y las vías urinarias

Síntesis de 7-ADCA.. Fermentación 2 1 3 Protección con ester: se prefiere bencil ester Disolución diluida de KMnO4 3) Enzima Expandasa (Streptomyces clavuligerus) 3) Cond. Acidas, Temp 75 – 175 ºC Tratar la penicilina con agente oxidante Primero tengo que protegerlo prevenir la degradación del núcleo El bencil ester es facilmente convertido en el acido nuevamente por hidrogenación catalitica 1) 7 –ADCA: ácido 7-aminodesacetoxicefalosporánico

Síntesis de Cefalexina Ver diap #26 Si se usa PGA (fenilglicinamida) se libera: NH4+; y se se usa un ester de fenilglicina se libera: PGE: R-OH

SINTESIS ENZIMÁTICA DE CEFALOSPORINAS Enzimic synthesis ofcephalosporins JACS

Generalmente síntesis por acilación con acidos orgánicos. Enzimic synthesis ofcephalosporins JACS

Síntesis de la Cefalexina

Problemas Preparación de Cefalexina con 7-ADCA Se aisla con derivado de D-difenilglicina (PGA o PGE) La reacción de acilación nunca se completa Recuperación y tratamiento de mezcla son difíciles: Recuperada en forma cristalina de una solución acuosa: oclusión de compuestos e impurezas originadas por la mezcla de reacción, productos indeseables, reactivos iniciales

Problemas Purificación del producto final: propiedades ácido base y solubilidades de Cefalexina y 7ADCA y fenilglicina son muy parecidas. COPRECIPITACIÓN CEFALEXINA IMPURA Distorsión del punto isoeléctrico y por ende la precipitación de la cefalexina.

La precipitación es afectada por el valor de pH de la mezcla de reacción en el punto isoeléctrico de la cefalexina. Riesgo de coprecipitación de productos indeseables como el 7ADCA y fenilglicina que tiene puntos isoelectricos muy cercanos a cefalexina.

Para recordar: Punto isoeléctrico: pH al que una sustancia anfótera tiene carga neta cero. A este valor de pH la solubilidad de la sustancia es casi nula. PI de Cefalexina: 4.5 a 5 PI 7-ADCA: 4 En mezcla de reacción éstos varían pero siempre sigue siendo mayor el de la cefalexina! A pH menor al punto isoeléctrico se protona la amina y a pH mayor se desprotona el ácido carboxílico. En ambos casos por formación de sales la solubilidad aumenta. PODRÍA PRTONARSE LA AMINA DEL BI-CICLO PERO BAJO ESTAS CONDICIONES NO SUCEDE!!!!

Cefalexina… Anfótera

7-ADCA

En otras patentes… 1) Proponen utilizar agentes formadores de complejos: Naftol Ventajas: Compuestos con dos núcleos aromáticos: complejo formado es relativamente estable y no son tóxicos. No es necesario ajustar el pH de la solución al punto isoeléctrico de la cefalexina para lograr precipitar No se forman coprecipitados de 7ADCA y fenilglicina Desventaja: sustancia adicional al procedimiento

En otras patentes… 2) La mezcla Cefalexina – 7ADCA se recristaliza en solvente orgánico (diclorometano, DMSO) con componente alcalino (diisopropilamina). DESVENTAJAS: SUSTANCIAS ORGÁNICAS EXTRAÑAS

En esta patente INNOVACIÓN: Procedimiento para la recuperación de Cefalexina a partir de una mezcla que contiene Cefalexina y ácido 7-aminodesacetoxicefalosporínico (7–ADCA). Objetivo: Recuperar Cefalexina purificada sin utilizar sustancias orgánicas extrañas

Es posible, mediante una reducción del pH a un rango establecido (entre 5.6 y 7.6), cristalizar la cefalexina 90% pura. Así se evita la perdida de componentes valiosos: 7 ADCA ($46/Kg)

Si el pH de la mezcla se baja aún más (1. 5 – 5 Si el pH de la mezcla se baja aún más (1.5 – 5.5) se cristalizan el 7-ADCA más Cefalexina. Luego se hace una Filtración Sucesiva La mezcla se reutiliza: obtención de cefalexina pura SIN PERDIDAS SIGNIFICATIVAS DE 7-ADCA.

Cantidad de D-fenilglicina Mezcla producto de acilación del 7-ADCA con D-fenilglicinamida realizada a pH alto Cristalización de PG y no de Cefalexina pH Tenemos la mezcla de 7 adca con PGA y dependiendo de la cantidad de PG producto de la reacción, con la disminución de ph adecuada se puede dar la cristaliación del PG y separarlo de Cefalexina.

Esta disminución de pH se hace mediante…. Ácido sulfúrico Ácido clorhídrico Ácido nítrico Remoción física de Amoniaco pH Si se utilizó PGA como agente de acilación, o PGE se desprende NH4+ o ROH. El pH se mantiene constante titulando con AMONIACO (HIDRÓXIDO DE AMONIO)

Métodos de remoción de amoníaco Arrastre con vapor El vapor pasa por la muestra que será destilada. El vapor arrastra los componentes que serán destilados. Para separar disolventes de sólidos que no se arrastran.

Destilación a presión reducida La destilación al vacío se utiliza cuando el líquido tiene un punto de ebullición excesivamente alto o descompone a alta temperatura Amoniaco: pto eb. 27ºC

Evaporador de Capa Fina Operación unitaria utilizada para concentrar un soluto o para separar compuestos en solución. Aspas crean capa delgada de disolución que se distribuye por paredes internas del cilindro caliente. Vapor tiene flujo radial hacia adentro. Internamente hay un condensador adonde se recoje el destilado que se separa de la disolución. Puede llevarse acabo bajo vacío.

Torre de Aspersión Air-stripping Gas purificado entra en contacto con disolución removiendole el amoniaco.

Enzimas inmovilizadas Enzimas en procesos industriales: químicos, alimentarios, farmaceúticos. Gran actividad catalítica Gran especificidad hacia el sustrato Inestables en condiciones de trabajo Solubles en agua: dificil separación de sustratos y productos No se pueden reutilizar

Enzimas inmovilizadas Enzimas inmovilizadas: proceso biotecnológico económicamente rentable. Estabilidad, reutilización, reciclado, pureza Enzimas inmovilizadas: Se confina a la enzima en una región definida del espacio, se restringen, completa o parcialmente, los grados de libertad de movimiento de enzimas en un soporte.

Penicilina acilasa Derivadas de: Acetobacter Aeromonas Alcaligenes Aphanociadium Bacillus sp. Cephalosporium Escherichia Flavobacterium Mycoplana Protaminobacter Pseudomonas Xanthomas

Penicilina G acilasa de Pharma Biotechnology Hannover Penicilina G acilasa inmovilizada: Recordati Penicilina G acilasa de E. coli E. coli (Boeringher): Enzigel®