Serie Blanca: Morfología y Citoquímica Kevin Goad Katherine Miranda Moisés Serrano

Morfología de la Serie Blanca Moisés Serrano

Morfología de células halladas en frotis de sangre periférica de un individuo normal.

Célula madre Monoblasto Mieloblasto Linfoblasto Promielocito Promonocito Prolinfocito Mielocito Metamielocito Célula en banda Monocito Linfocito Célula segmentada

Estadios de Maduración en la Granulopoyesis MIELOBLASTO PROMIELOCITO MIELOCITO METAMIELOCITO BANDA SEGMENTADO

Mieloblasto TAMAÑO 11 a 18 µm NUCLEO FORMA Grande, oval, amorfo COLOR púrpura CROMATINA Laxa, fina, aspecto reticulado NUCLEOLO 2 a 5 CITOPLASMA Escaso e intensamente basófilo CONTENIDO No posee granulaciones Mieloblasto

Promielocito TAMAÑO 10 – 20 µm NUCLEO FORMA Excéntrico, redondo COLOR púrpura CROMATINA laxa NUCLEOLO puede o no tener CITOPLASMA Menos basófilo que el mieloblasto CONTENIDO Granulaciones azurófilas oscuras (primarias). Contienen: fosfatasa ácida, lisozima, mucopolisacáridos sulfatados y proteínas básicas Promielocito

Mielocito TAMAÑO 12 – 18 µm NUCLEO FORMA CROMATINA Más gruesa NUCLEOLO Excéntrico, redondo u oval. Menor tamaño CROMATINA Más gruesa NUCLEOLO No tiene CITOPLASMA CONTENIDO Aparecen granulaciones secundarias específicas, que varían dependiendo de la afinidad y que pueden cubrir el núcleo Mielocito Mieloblasto Promielocito Mielocito Metamielocito Célula en banda Célula segmentada

Mielocito Neutrófilo TAMAÑO 12 – 18 µm NUCLEO FORMA CROMATINA Excéntrico, redondo u oval. Menor tamaño CROMATINA Más gruesa NUCLEOLO No tiene CITOPLASMA COLOR Granulaciones azurófilas CONTENIDO Aparecen granulaciones secundarias específicas. Mielocito Neutrófilo

Mielocito Eosinófilo TAMAÑO 12 – 18 µm NUCLEO FORMA CROMATINA Excéntrico, redondo u oval. Menor tamaño CROMATINA Más gruesa NUCLEOLO No tiene CITOPLASMA COLOR Granulaciones grandes color rojo ladrillo CONTENIDO Aparecen granulaciones secundarias específicas. Mielocito Eosinófilo

Mielocito Basófilo TAMAÑO 12 – 18 µm NUCLEO FORMA CROMATINA Más gruesa Excéntrico, redondo u oval. Menor tamaño CROMATINA Más gruesa NUCLEOLO No tiene CITOPLASMA COLOR Granulaciones grandes color púrpura oscuro CONTENIDO Aparecen granulaciones secundarias específicas. Mielocito Basófilo

Metamielocito TAMAÑO 1 – 18 µm NUCLEO FORMA CROMATINA Compacta Tiene apariencia de frijol CROMATINA Compacta NUCLEOLO No tiene CITOPLASMA CONTENIDO Granulaciones secundarias específicas, que varían dependiendo de la afinidad de la célula y que pueden cubrir el núcleo Metamielocito Mieloblasto Promielocito Mielocito Metamielocito Célula en banda Célula segmentada

Metamielocito Neutrófilo TAMAÑO 1 – 18 µm NUCLEO FORMA Tiene apariencia de frijol CROMATINA Compacta NUCLEOLO No tiene CITOPLASMA COLOR Granulaciones azurófilas CONTENIDO Granulaciones secundarias los cuales contienen: fosfatasa alcalina, lisozima, aminopeptidasas, colagenasa y proteínas básicas. Se puede apreciar un 'sol naciente' por las características núcleo-citoplasma. Metamielocito Neutrófilo

Metamielocito Eosinófilo TAMAÑO 1 – 18 µm NUCLEO FORMA Tiene apariencia de frijol CROMATINA Compacta NUCLEOLO No tiene CITOPLASMA COLOR Granulaciones grandes color rojo ladrillo CONTENIDO Granulaciones secundarias los cuales contienen: fosfatasa alcalina, lisozima, aminopeptidasas, colagenasa y proteínas básicas. Afinidad con eosina Metamielocito Eosinófilo

Metamielocito Basófilo TAMAÑO 1 – 18 µm NUCLEO FORMA Tiene apariencia de frijol CROMATINA Compacta NUCLEOLO No tiene CITOPLASMA COLOR Granulaciones grandes color púrpura oscuro CONTENIDO Granulaciones secundarias los cuales contienen: fosfatasa alcalina, lisozima, aminopeptidasas, colagenasa y proteínas básicas. Metamielocito Basófilo

Célula en Banda TAMAÑO 10 – 16 µm NUCLEO FORMA CROMATINA Compacta Indentación pronunciada con forma de herradura CROMATINA Compacta NUCLEOLO No tiene CITOPLASMA CONTENIDO Granulaciones secundarias específicas, que varían dependiendo de la afinidad de la célula y que pueden cubrir el núcleo Célula en Banda Mieloblasto Promielocito Mielocito Metamielocito Célula en banda Célula segmentada

Neutrófilo en Banda TAMAÑO 10 – 16 µm NUCLEO FORMA CROMATINA Compacta Indentación pronunciada con forma de herradura CROMATINA Compacta NUCLEOLO No tiene CITOPLASMA COLOR Granulaciones azurófilas CONTENIDO Granulaciones secundarias específicas, que varían dependiendo de la afinidad de la célula y que pueden cubrir el núcleo Neutrófilo en Banda

Eosinófilo en Banda TAMAÑO 10 – 16 µm NUCLEO FORMA CROMATINA Compacta Indentación pronunciada con forma de herradura CROMATINA Compacta NUCLEOLO No tiene CITOPLASMA COLOR Acidófilo CONTENIDO Granulaciones secundarias específicas, que varían dependiendo de la afinidad de la célula y que pueden cubrir el núcleo Eosinófilo en Banda

Basófilo en Banda TAMAÑO 10 – 16 µm NUCLEO FORMA CROMATINA Compacta Indentación pronunciada con forma de herradura CROMATINA Compacta NUCLEOLO No tiene CITOPLASMA COLOR Granulaciones grandes color púrpura oscuro CONTENIDO Granulaciones secundarias específicas Pueden cubrir el núcleo Basófilo en Banda

Célula segmentada TAMAÑO 8 – 14 µm NUCLEO FORMA CROMATINA Compacta Lobulaciones CROMATINA Compacta NUCLEOLO No tiene CITOPLASMA CONTENIDO Granulaciones secundarias específicas, que varían dependiendo de la afinidad de la célula y que pueden cubrir el núcleo Célula segmentada Mieloblasto Promielocito Mielocito Metamielocito Célula en banda Célula segmentada

Neutrófilo segmentado TAMAÑO 12 – 14 µm NUCLEO FORMA 2 a 5 segmentos unidos por cromatina CROMATINA Compacta NUCLEOLO No tiene CITOPLASMA COLOR Granulaciones azurófilas CONTENIDO Gránulos numerosos y finos de color violeta rojizo que se distribuyen uniformemente Neutrófilo segmentado

Eosinófilo segmentado TAMAÑO 8 – 12 µm NUCLEO FORMA bilobulado CROMATINA Compacta, densa NUCLEOLO No tiene CITOPLASMA COLOR Granulaciones grandes color rojo ladrillo CONTENIDO Granulaciones grandes, esféricas y numerosas color rojo ladrillo que rodean al núcleo Eosinófilo segmentado

Basófilo segmentado TAMAÑO 8 – 10 µm NUCLEO FORMA polimorfismo CROMATINA Compacta NUCLEOLO No tiene CITOPLASMA COLOR Granulaciones grandes color púrpura oscuro CONTENIDO Numerosos gránulos color púrpura que cubren casi todo el núcleo Basófilo segmentado

Monoblasto Tamaño celular: Diametro de 15 – 20 um Núcleo: -Irregular. -Presenta muesca o circunvalacion -Cromatina fina y nucleolos Citoplasma: -Basófilo -Puede presentar vacuolas.

Promonocito Núcleo: -Cromatina mas condensada Citoplasma: -Basófilo

Monocito Tamaño celular: Diametro de 15 – 20 um Núcleo: -Grande e irregular. -Presenta muesca o circunvalacion -Cromatina finamente reticulada que se tiñe con suave intensidad. Citoplasma: -Abundante -Ligeramente basófilo con o sin vacuolas -Granulaciones azurofilas finas.

Linfoblasto Tamaño celular: Diametro de 15 – 20 um Núcleo: -Grande y redondo. -Cromatina fina -Frecuente observar nucleolos Citoplasma: -Basófilo -Sin granulaciones.

Prolinfocito Tamaño celular: diámetro de 15 um. Núcleo: -Cromatina mas finamente dispersa que la del linfocito -nucleolos Citoplasma: -Basófilo -Sin granulaciones.

Linfocito Tamaño celular: 5 – 12 um los de escaso citoplasma. 15 – 20 um los de abundante citoplasma. Núcleo: -Redondo u oval -Cromatina densa Citoplasma: -Ligeramente basofilo -Escaso o abundante -Pueden presentarse escasa granulacion de color rojo purpura o azurofilas, denominadas perforinas.

Pruebas citoquímicas applicadas a las células sanguíneas Kevin Goad

Enzimas (oxidantes e hidrolíticas) Citoquímica La citoquímica estudia la composición química de la célula y permite detectar la localización topográfica de algunos principios inmediatos, enzimas, metales pesados y otras sustancias. Se considera como un nexo de unión entre la morfología y la bioquímica. Los componentes celulares que son posibles revelar con el estudio citoquímico son: Enzimas (oxidantes e hidrolíticas) Glucógeno Lípidos

Peroxidasa La demostración citoquímica de esta enzima se basa en la acción oxidante de la peroxidasa sobre el substrato, bencidina, en presencia de peróxido de hidrógeno, apareciendo un precipitado amarillo ocre en el lugar del citoplasma en donde se ha producido la reacción. La mieloperoxidasa se sintetiza en el retículo endoplasmático rugoso, de donde pasa a las cisternas del aparato de Golgi quedando localizada fundamentalmente en la granulación 1ª o azurófila. Se localiza sobre todo, en los gránulos primarios de los neutrófilos y precursores, así como en los gránulos de los eosinófilos y monocitos. Dicha enzima se combina in vivo con peróxido de hidrógeno transformándose en un potente agente bactericida, viricida y fungicida.   La aplicación fundamental de la mieloperoxidasa se refiere a la capacidad discriminatoria entre celularidad blástica mieloide y linfoide, ya que los mieloblastos muy precoces sin estigmas de diferenciación mieloide ya pueden ser mieloperoxidasa positivos. Un déficit de mieloperoxidasa en los PMN maduros, excepto en el caso de que se trate de una deficiencia congénita, debe interpretarse como un signo disgranulopoyético.

Peroxidasa La aplicación fundamental de la mieloperoxidasa se refiere a la capacidad discriminatoria entre celularidad blástica mieloide y linfoide, ya que los mieloblastos muy precoces sin estigmas de diferenciación mieloide ya pueden ser mieloperoxidasa positivos.

Peroxidasa La aplicación fundamental de la mieloperoxidasa se refiere a la capacidad discriminatoria entre celularidad blástica mieloide y linfoide, ya que los mieloblastos muy precoces sin estigmas de diferenciación mieloide ya pueden ser mieloperoxidasa positivos.

NEGRO B DE SUDÁN Es una coloración no enzimática útil en patología mieloide. Tiñe los fosfolípidos y otros lípidos, colorea los gránulos azurófilos y específicos de los granulocitos y tiene la ventaja de que con el tiempo no disminuye la actividad. Los neutrófilos segmentados y sus precursores muestran unos gránulos gruesos en el citoplasma de color gris muy oscuro.

NEGRO B SUDÁN En la Diapositiva vemos tres células marcadas como D, E, F. D = Monocito ( vemos que está levemente teñido por el negro sudán) E = Linfocito es negativo para esta tinción. F = Neutrofilo es fuertemente teñido.

Cuadro comparativo Peroxidasa- Negro B Sudan. Célula Peroxidasa Negro B Sudan Mieloblasto Cuerpo de Auer Granulocitos +++ Monocitos + Linfocitos --- Cuerpo de auer se explicará más adelante cuando hablemos de esterasas específicas.

Fosfatasas Alcalina La fosfatasa alcalina hidroliza monoésteres del ácido fosfórico, actuando a un pH de 9,1 a 9,6. La demostración citoquímica se basa en la hidrólisis de ciertos substratos, de los cuales se liberan unos productos intermedios que combinados con una sal diazoica dan un precipitado coloreado en el citoplasma celular. Se encuentra actividad FA en algunas células maduras y semimaduras de la granulopoyesis neutrófila (bandas y segmentados). Su Utilidad primordial es distinguir síndromes mieloproliferativos ( FAG disminuido) Versus las reacciones neutrofilas secundarias a procesos infeccioso (FAG aumentado) .

Fosfatasa Alcalina No todos los granulocitos presentan el mismo grado de positividad; en función de este dato se establece un índice de actividad de FA. Se pueden distinguir 5 tipos de reacción: Grado Nivel de positividad Multiplo en la escala del FAG Grado 0 - - Grado 1 - + 1 Grado 2 + 2 Grado 3 ++ 3 Grado 4 +++ 4

Fosfatasa Alcalina Se realiza un recuento sobre 100 granulocitos asignando a su valor según grado .Se suman los valores y el número obtenido es el índice de FAG, que tiene un valor mínimo de 0 y máximo de 400. El índice normal oscila entre 20 y 100. # de grado de actividad de FAG # de células observadas FAG 20 1 23 2 27 54 3 19 57 4 6 24 5 25 total 100 183 # de grado de actividad de FAG # de células observadas FAG 90 1 10 2 3 4 5 total 100 # de grado de actividad de FAG # de células observadas FAG 37 1 43 2 16 32 3 4 12 5 total 100 87 Los rango de los valores de recuento leucocitario son : 40 -100 por cada 100 neutrofilos Y este valor es mayor en niños y en mujeres que en hombres, los recien nacidos pueden tener rangos de 150-300 en el indice FAG. Valor del FAG menos de 13 me confirma la presencia de un síndrome mieloproliferativo, un valor mayor de 100 me indica que estamos frente una reacción mieloide secundaria a un proceso infeccioso.

Fosfatasa Alcalina La demostración de la fosfatasa alcalina en leucocitos para fines diagnósticos se debe a la observación de ligeros grados de actividad O ausencia de actividad en casos de leucemia granulocitica versus la reacción leucemoide por infección en la cual los valores de está enzima Están aumentados.

Fosfatasa Ácida Es una enzima hidrolítica perteneciente al grupo de las fosfomonoesterasas, que actúa sobre los ésteres del ácido fosfórico; su pH óptimo de actuación oscila entre 4,7 y 5,5. Se trata de una enzima de ubicación lisosómica. La demostración citoquímica se basa en la hidrólisis del substrato naftol-AS-Bi-fosfato, liberándose unos productos intermedios que al combinarse con una sal diazoica dan un precipitado de color rojo anaranjado en el citoplasma.

Fosfatasa Ácida La tricoleucemia (o leucemia de células peludas es un síndrome linfoproliferativo crónico de células B) es un proceso linfoproliferativo en que el estudio de la FA ofrece un particular interés por cuanto la actividad enzimática a pesar de ser una célula linfoide es difusa, intensa y tartrato resistente. Se utiliza para demostrar la isoenzima 5 en el tricoleucocito. De todas formas, con el advenimiento de los anticuerpos monoclonales, la técnica citoquímica en el estudio de los síndromes linfoproliferativos crónicos ha perdido predicamento. La técnica citoquímica ha perdido importancia con la llegada de los anticuerpos monoclonales, que son más utilizados para la confirmación de estas patologías.

Fosfatasa Ácida La utilidad actual de esta tinción se basa en que la reacción es inhibida al adicionar el reactivo de tartrato en la mezcla de incubación De células granulociticas , pero no así en los linfocitos sobre todo si son de tipo maligno como Leucemia de células peludas o vellosas.

Esterasas Esterasas Específicas Esterasas No específicas En la mayoría de las células hematopoyéticas están presentes muchas esterasas , su utilidad básicamente rádica en la capacidad de diferenciar las lineas celulares Mielociticas y Monociticas esta producción de esterasa se puede observar incluso desde antes de que se puedan ver los gránulos con tinción de WRIGHT.

Esterasas Específicas Se realiza mediante la tinción de Naftol AS-D Cloroactetato esterasa (NASD) , el reactivo actúa sobre esterasas cloradas y que precipitan como gránulos gruesos. Prueba + linea celular Mielocitica. Los cuerpos de auer son positivos por que la tinción es similar en sensibilidad a la Negro B Sudán. Los cuerpos de Auer son :Inclusiones citoplasmáticas en forma de bastón constituídas por gránulos alineados. Estos gránulos tienen actividad de fosfatasa. Tiñen positivamente con la mieloperoxidasa y el negro Sudán B. Se presentan en los mieloblastos y más raramente en los monoblastos.

Esterasa específica Reactivo Naftol – cloro – acetat esterasa NASD aquí se observan los precipitados pardos de la serie celular Mielocitica.

Esterasa Inespecífica La mayoria de las tinciones no específicas se observan en la línea Monocitica. Esta tinción utiliza el Naftil Butirato que precipita las esterasas en forma de gránulos coloreados , observandose mayor presencia en MONOCITOS.

Esterasa Inespecifíca El reactivo de esta prueba puede ser alfa – naftil – acetato o el naftil butirato. Me identifica los monocitos.

PAS- Reacción del ácido peryodico de Schiff. La reacción de PAS se basa en la rotura de los enlaces -C-C- presentes en los carbohidratos(glucogeno) por la acción del ácido peryódico, potente agente oxidante, liberándose grupos aldehído que al combinarse con el reactivo de Schiff dan un compuesto de color rojo púrpura intenso. Identifica al glucógeno en el citoplasma celular. El ácido peryodico al romper los enlaces C-C se forman reacciones intermedias con excesos de SO2 que origina el compuesto coloreado , a reacción de las células hemáticas al PAS difiere en casos de enfermedad y pueden ser de cierto valor diagnóstico. Sirve para detectar Leucemias en fase aguda , tiene cierto valor diagnóstico , puesto que a medida que la célula madura adquiere mayor concentración de glucogeno.

PAS A.El monocito presenta positivadad parcial. B. El linfocito es negativo C. Neutrofilo presenta positividad.

Tinciones Citoquímicas Peroxidasa / Negro Sudán + - Leucemia Mielocitica Aguda Leucemia Monocitica Aguda Leucemia Linfocitica Esterasas PAS + Específica No Inespecífica Marcadores celulares + + Reactivo de esterasas Específica----- Naftol AS-D Cloroactetato esterasa (NASD) Inespecífica ---- Alfa Naftil Butirato Linfocitos B Leucemia Monocitica aguda Leucemia Mielocítica aguda + Células NK Leucemia Mielomonocitica aguda Linfocitos T

Tinción Reactivos Tipo de reacción Utilidad Peroxidasa Bencidina + H2O2 Enzimática Discriminación de Células Mielomonocíticas Negro B sudán Tinte Negro B sudán Tinción de Fosfolípidos Discriminación de Células Mielomonocíticas Fosfatasa Alcalina Fosfatasa y pH 9.1 a 9.6 Coloración de gránulos Sindrome Mieloproliferativo (FAG disminuido.) Fosfatasa Ácida Fosfatasa y pH 4.7 a 5.5 y substrato naftol-AS-Bi-fosfato Coloración de células B Tartaro resistente Identificación de Tricoleucemias( Leucemia de Célula B peluda). Esterasa Específica Naftol AS-D cloroacetato esterasa Enzimática precipitación de esterasa Leucemia Mielocítica aguda Esterasa Inespecífica Naftil Butirato Leucemia Monocítica aguda PAS Ácido Peryodico de Schiff Ruptura de C-C Leucemias agudas.

Valoración del Sistema Inmune Por: Katherine Miranda

INMUNIDAD HUMORAL CELULAR PMN M CPA LB TH TC TD TS

NEUTRÓFILOS 1ª línea de defensa. > Acción sobre bacterias piógenas Función fagocítica, pinocítica y bactericida. NEUTRÓFILOS Gránulos azurófilos o primarios: mieloperoxidasa, proteasas neutras, betaglucoronidasa, hidrolasas ácidas, fosfatasa ácida, catepsinas, defensinas Gránulos secundarios, más pequeños: lisozima, fosfatasas alcalina, lactoferrina, colagenasa

Intervención en metabolismo de hierro 2ª línea de defensa Principales productores de citocinas del S.I. Innato (IL-1, IL-6, IL-8, IL-12, TNF-α) Funciones: Fagocitosis CPA Moderan la R.I. Hemostasia Intervención en metabolismo de hierro Macrófagos el sistema inmunitario sólo reconoce lo "ajeno" si es presentado por lo "propio".

Distribución de los macrófagos Macrófagos de los Ganglios linfáticos Macrófagos de la microglia Macrófagos alveolares Células de Kupffer (hepáticas) Macrófagos esplénicos (sinusoidales) Macrófagos mesangiales Osteoclastos Macrófagos peritoneales Células A (sinoviales)

Los linfocitos T colaboradores reconoce el antígeno y se liga al macrófago  estimula la producción de sustancias químicas (IL-1, TNF/ IL-2, INF-ץ)

Eosinófilos La mayoría son atraídos por quimiotaxis. Regulan la respuesta alérgica y las reacciones de hipersensibilidad mediante la neutralización de la histamina por la histaminasa. Receptores para IgE. Acción en alergia y en la defensa contra parásitos.

Eosinófilos Juegan un papel de defensa del huésped frente a microorganismos no fagocitables, poseen: función citotóxica (por sus proteínas granulares). inmunorreguladora (por las citocinas que libera). son capaces de participar en la reparación y remodelación tisular (liberando TGF-β).

Mediador de la Inflamación 0-1 % en S.P.

Fagocítica, Pinocítica, Bactericida. 50-70 Monocito Fagocitosis 2-6 Célula Función (es) Sangre Periférica (%) Neutrófilo Fagocítica, Pinocítica, Bactericida. 50-70 Monocito Fagocitosis 2-6 Eosinófilo Parasitemias, Reacciones alérgicas 2-4 Basófilo Mediadores de la inflamación 0-1 Linfocitos T Respuesta Celular: Activan LB, Defensa microbiana, modulan la respuesta inmune 70 Linfocitos B CPA, Cél. Prod. de Inmunoglobulinas, Respuesta Humoral 20 Células NK Identificación y Destrucción de células foráneas 10

Preguntas ???? ¡Gracias!

Referencias Libro Cuestiones en Hematología edición 2002, editorial Elsevier, España, ISBN: 8481746088 Manual Amir Hematología – edición 2009 Manual CTO Hematología séptima edición, autor grupo CTO. Manual de Laboratorio de Hematología de la facultad de medicina de la Universidad de Panamá. Autor: Dr. Altafulla 2003. Imágenes cortesía de www.telmeds.org