Talasemias Talasemias II  Dra. Silvia Varas qbpatologica.unsl@gmail.com

Hemólisis: Formación de hemicromos Los hemicromos se unen a banda 3, banda 4,1,anquirina y Espectrina y catalizan su oxidación. Hay una disminución de afinidad con la anquirina y liberación del citoesqueleto (espectrina/actina). Agrupación y Aumenta la movilidad lateral en la bicapa (clustering) de Banda 3. Formación de agregados. Progresiva vesiculación. Perdida de la membrana plasmática y LISIS celular

Exposición Fosfatidilserina (FT) Formación Hemicromos  especies tóxicas de Fe  especies reactivas al oxigeno (radicales libres)  Lipoperoxidación  Ca2+  Activación Canales Gardos  Exposición Fosfatidilserina (FT) Activación complejo Protrombina Activación de las Plaquetas

Apoptosis de precursores Normalmente: Hipoxia   Eritropoyetina (EPO), EPO  la expresión de Bcl-XL, un gen antiapoptótico. - EPO inhibe la expresión del canal Gardos (K+,Ca2+). Precursores eritroides con -talasemia: - Los precursores eritroides inmaduros tienen  de la expresión de Bcl-XL y expresan el receptor de membrana, Fas. - Los precursores eritroides más maduros expresan Fas-ligando. TEORIA: Se ha propuesto que en islas de eritroides en medula ósea, la interacción Fas con Fas-ligando puede producir una retroalimentación negativa sobre la eritropoyesis y EPO. Activación de caspasa 3, 7, y 8 los que luego degradan factor de trascripción GATA,(factor requerido para la diferenciación eritroide)  APOPTOSIS CELULAR

Biología molecular Talasemias

Estructura molecular de los genes a-globina duplicados

Entrecruzamiento hacia la derecha Entrecruzamiento hacia la izquierda

b-talasemia Clasificación Relación Fenotipo/ Mutación: Beta +: La mutación no impide que el gen sintetice algo de globinas beta. Beta 0: La mutación impide totalmente la síntesis de globinas beta, bien porque no se produce RNAm o bien porque se produzca pero no sea traducible. 

Los genes de las globinas: Consiste de estructuras exon e intrones. Se refieren al ADN codificante y no codificante, respectivamente, del gen. INTRONES Inicia con un sitio dador consenso (G100U100A62A68G84U63..) Tiene un punto de ramificación cercano al sitio 3’ del intron (no es un sitio consenso muy conservado UACUAAC) Finaliza con un sitio aceptor consenso (12Py..NC65A100G100) UG AG UACUAAC

5’ 3’ NUCLEO CITOPLASMA Transcripción Capping y Poliadenilación GT AG TGA -200-500 FT Caja GC -90 Caja CAAT -75 -30 TATA 5’ 3’ Enhancer 5’ UTR +1 3’ UTR FTII RNA pol II + Transcripción UGA Señal de clivaje y poliadenilación20-30nt 5’ UTR GU AG GU AG 3’ UTR AAUAAA RNA Transcripto Primario Capping y Poliadenilación NUCLEO UGA CAP 5’ UTR GU AG GU AG 3’ UTR AAAAAAAAA 7-metilguanosina Splicing RNA nuclear pequeño (snRNA) Spliceosoma UGA GU GU CAP 5’ UTR AG AG 3’ UTR AAAAAAAAA UACUAAC GU Lazo o LARIAT AG RNA mensajero MADURO CAP 5’ UTR 3’ UTR AAAAAAAAA CITOPLASMA

Mutaciones:tipos

PCR+ ER

87,5%

Estrategias: Se produce una perdida o ganancia sitio de corte ER: PCR+ ER (algunos la refieren como RFLP-PCR). No hay cambio: Análisis con Dot Blot + Sondas ASO (Oligonucleótidos Alelo Especificas), ARMS

726 pb WT WT

Otro ejemplo: Hb S: La mutación de Hb S en el codon 6, destruye el sitio de reconocimiento de la enzima Dde I.

Se usa para la detección de Mutaciones puntuales (que no afectan sitios de cortes de una Enzima de restricción) Análisis con Dot Blot + Sondas ASO (Oligonucleótidos Alelo Especificas)

Una vez que tenemos los dot blot revelados, identificamos cada una de las muestras sembradas y observamos el resultado correspondiente a cada sonda. 1 2 3 4 5 6 7 8 7: control negativo de la PCR 8: control negativo de hibridación (gen de tiroglobulina) 1: portador de la mutación 1 –1 2: portador de la mutación 1 –1 3: portador de la mutación 1 - 110 4: portador de la mutación 39 5: portador de la mutación 39 6: normal

Alfa Talasemias MUTACIONES

 +



a- Talasemias: Southern Blot y análisis de la secuencia de ADN Gap-PCR Otro método es el MLPA (Amplificación de Sondas dependiente de Ligamiento Múltiple

Variante de una PCR-multiplex Gap- PCR Variante de una PCR-multiplex

Se utiliza gap-PCR para diagnóstico de:

GAP-PCR Una gran deleción reune a los primers AC y se produce la amplificación Usada en la identificación de deleciones en el gen de - globina. A B C Normal: A and B da un producto; A y C están demasiados apartados no hay producto PCR Deleción: A y C ahora dan un producto, el cual es diferente en tamaño al producto A y B.

Delecion African HPFH-2 M N

a- Talasemias: Amplificación de Sondas dependiente de Ligamiento Múltiple (MLPA)

Característica General La amplificación es de las sondas de MLPA, no de las muestra de ADN. El pattern de los picos son generadas sobre la muestras de un paciente y una muestra de ADN de referencia. Se compara la altura relativa de los picos. Las diferencias reflejan los cambios en el número de copias detectados por las probes de MLPA. Mas de 50 probes están presentes en una reacción de MLPA

Deleciones

Bibliografía general: LEHNINGER ALBERT L., COX MICHAEL M., NELSON DAVID L. “Principios de Bioquímica”. Editorial OMEGA 4º Edición. 2006. Diapositivas en Power Point (formato ppt) (Manual para docentes) LEHNINGER ALBERT L., COX MICHAEL M., NELSON DAVID L. “Principios de Bioquímica” Web: http://bcs.whfreeman.com/lehninger/ The Journal of Biological Chemistry: Classic Articles Web: www.jbc.org VOET DONALD, VOET JUDITH G. “Bioquímica” Editorial MÉDICA PANAMERICANA. 3º Edición, en Español. 2006 WATSON, BAKER, BELL, GANN, LEVINE, LOSICK “Biología Molecular del Gen” Editorial MÉDICA PANAMERICANA. 5º Edición, en Español. 2006 STRYER LUBERT, BERG JEREMY M., TYMOCZKO JOHN L. ”Bioquímica” Editorial REVERTE. Edición 5º Edición, en Español. 2003 MATHEWS CHRISTOPHER K., AHERN KEVIN G., VAN HOLDE K. E. ”Bioquímica” Editorial PEARSON EDUCACION. 3º Edición en Español. 2003 Diapositivas (formato ppt), Problemas (Manual para docentes) y Casos Clínicos de Aplicación VOET DONALD, VOET JUDITH G. and PRATT CHARLOTTE W. “Fundamentals of Biochemistry” Second Edition. Copyright © 2006 by John Wiley & Sons, Inc Web: www. medicapanamericana.com/voet/

Bibliografía especifica: Alvarez SM, Varas SM, Meloni AM, Giménez AI y Giménez MS. 2000. Incidencia de la beta -talasemia en San Luis, Argentina. Acta Bioquímica Clínica Latinoamericana: 35 (1) 75-82 Alvarez, Silvina M. (1999). Trabajo Final de Tesina en Biología Molecular ‘’ Rastreo de pacientes - talasémicos: estudio bioquímico y molecular. UNSL. Biblioteca Central. Weatherall DJ y col. Chapter 93: The hemoglobinopathies. Book II. The metabolic and molecular basis of inherited disease. Scriver CR, Beaudet AL, Sly WS & Valle D. 7º Edition. 1995. New York Mc Graw-Hill. Fundación Argentina de Talasemia "FUNDATAL" http://www.fundatal.org.ar Ronald J A Trent. Diagnosis of the Haemoglobinopathies. Clin. Biochem. Rev. Vol 27 February 2006

Bibliografía especifica: Charles R. Scriver, Arthur L. Beaudet, William S. Sly and David Valle: THE METABOLIC AND MOLECULAR BASES OF INHERITED DISEASE. Volume I,II and III. Seventh Edition.Mc Graw-Hill Editors Trabajos publicados en revistas de la especialidad. BLOG: http://qbpatologica.wordpress.com/