ESCUELA POLITÉCNICA DEL EJÉRCITO DEPARTAMENTO DE CIENCIAS DE LA VIDA BIOTECNOLOGÍA-CULTIVO DE TEJIDOS “ Evaluación de la actividad hormonal de: Thidiazuron (TDZ), Thidiazuron con ácido α-naftalen acético (TDZ/ANA) Vs. 6 – Bencil amino purina (BAP), 6 – Bencil amino purina con ácido α-naftalen acético (BAP/ANA); como inductores de brotes en la etapa de multiplicación a partir de yemas apicales de Balsa (Ochroma lagopus).” Previo a la obtención de título de Ingeniero en Biotecnología Directora: M.Sc. Mónica Jadán Codirector: Ing. Pedro Romero Autor: David Dávila A. Sangolquí, 09 de Diciembre 2011

OBJETIVOS ESPECÍFICOS OBJETIVO GENERAL Estandarizar métodos de micropropagación para la obtención de clones viables de plantas de Balsa (Ochroma lagopus) mediante su cultivo in vitro. OBJETIVOS ESPECÍFICOS Establecer protocolos de: establecimiento, multiplicación y enraizamiento de Balsa (Ochroma lagopus). Evaluar los métodos estandarizados de cultivo y micropropagación in vitro de Balsa (Ochroma lagopus). Obtener plántulas de Balsa (Ochroma lagopus) para su uso potencial en la industria maderera.

Marco teórico

Clasificación taxonómica Nombre científico: Ochroma lagopus Género: Ochroma Familia: Bombacaceae Orden: Malvales Clase: Magnoliopsida División/Phylum: Magnoliophyta Reino: Plantae

Distribución natural de la balsa, Ochroma lagopus, en el neotrópico. Fuente: Tomado de K. Francis, John, 2002

Justificación del Problema El árbol de Balsa es utilizado en la reforestación de bosques afectados por la tala indiscriminada Las especies de interés son de ciclo largo, su reproducción es lenta y en el caso vegetativo es dificultoso La propagación clonal de Balsa utilizando yemas apicales (asexual) es mas eficiente comparada con la propagación por su semillas (sexual) Es común la estacionalidad de la producción de la semilla sexual. Genera madera liviana y de buena calidad. La maduración física y económica ocurre cuando esta posee una edad temprana, de 5 a 6 años. Garantiza plantas libres de enfermedades y características fenotípicas buenas. Permite almacenar un resguardo del material clonal por largo tiempo y en espacios pequeños.

Justificación del Problema La Balsa es un recurso forestal y maderable susceptible de explotación industrial gracias a su rápido crecimiento La especie es de importancia comercial, en nuestro país en la cuenca del río Guayas , en donde se obtiene el 95 % de la cosecha mundial. Ecuador posee, más de 20 mil hectáreas de plantaciones, a partir de las cuales ha generado exportaciones a más de 45 países

Cultivo in vitro Sobre una superficie pequeña. Optimización de las condiciones ambientales. Elimina por completo la presencia de microorganismos y organismos patógenos o plagas.

Etapas del cultivo in vitro

Hipótesis El Thidiazuron TDZ y el Thidiazuron con el ácido α-naftalen acético (TDZ/ANA), es el mejor inductor de brotes en la etapa de multiplicación a partir de yemas apicales de Balsa (Ochroma lagopus).

Materiales y métodos

Etapa I: Introducción (a) (b) Plantas de balsa en condiciones de invernadero sometidas a tratamiento fitosanitario. Medición de tamaño promedio para cumplir condiciones fenotípicas. (a) (b)

Etapa II: Desinfección (b) (c) (d) (e) (f) Protocolo de Desinfección: (a)Yemas apicales (b)Lavado en agua corriente. (c) Lavado en agua estéril. (d) Combinación de fungicidas. (e) Alcohol. (f) Cloro.

Etapa III: Siembra (a) (b) Procedimiento mecánico para la eliminación de tricomas. Yema apical de Balsa, se distingue presencia de tricomas. (a) (b)

Medio de cultivo Las concentraciones usadas fueron: agar 6,5 g/L Azúcar 25 g/L Sulfato de adenina 0,5 mg/L L – Cisteína 30 mg/L Ácido ascórbico 30 mg/L Carbón activado 200 mg/L Inositol 100 mg/L Amistar TOP (Azoxystrobin, Difenoconazol) 50 ul/L pH 5,7 El medio de cultivo fue esterilizado en el autoclave durante 30 minutos a 121oC y 15 PSI.

Etapa de desinfección Tratamiento Concentración de cloro % Tratamientos de desinfección utilizando hipoclorito de sodio Tratamiento Concentración de cloro % Tiempo de Inmersión (min) 1 0,5 40 2 1,0 30 3 1,5 20 4 2,5 10

Resultados y discusión

Contaminación Tabla de comparación de Fisher para la contaminación con respecto a la concentración de hipoclorito de sodio y sus respectivos tiempos de inmersión.

Necrosis Tabla de comparación de Fisher para la necrosis con respecto a la concentración de hipoclorito de sodio y sus respectivos tiempos de inmersión.

Supervivencia Tabla de comparación de Fisher para la supervivencia con respecto a la concentración de hipoclorito de sodio y sus respectivos tiempos de inmersión

Contaminación, Necrosis y Supervivencia   Explantes vivos, explantes contaminados, explantes necrosados en los tratamientos de hipoclorito de sodio: Tratamiento 1 (0.5% - 40 min) Tratamiento 2 (1.0% - 30 min) Tratamiento 3 (1.5% - 20 min) Tratamiento 4 (2.5% - 10 min).

Concentración de fungicida % Tiempo de Inmersión (min) Desinfección con fungicidas más hipoclorito de sodio 0,5% y 40 min de inmersión Tratamiento Concentración de fungicida % Tiempo de Inmersión (min) 5 Captan 0,1 15 6 Cobre Nordox 0,1 7 Amistar 0,1 8 Amistar 0,3 9 Captan 0,1+Cobre Nordox 0,1 10 Amistar 0,1+Captan 0,1 11 Amistar 0,1+Cobre Nordox 0,1 12 Amistar 0,3+Captan 0,1 13 Amistar 0,3+Cobre Nordox 0,1 14 Amistar 0,3+Cobre Nordox 0,1+Captan 0,1

Contaminación Tabla de comparación de Fisher para la contaminación con respecto a concentración de hipoclorito de sodio 0,5% - 40 min, mezclada con la concentración de fungicida y la mejor combinación de fungicida.

Necrosis Tabla de comparación de Fisher para la necrosis con respecto a la concentración de hipoclorito de sodio 0,5% - 40 min, mezclada con la concentración de fungicida y la mejor combinación de fungicidas.

Supervivencia   Tabla de comparación de Fisher para la supervivencia con respecto a la concentración de fungicida y combinaciones de fungicida con el mejor tratamiento de hipoclorito de sodio (0.5% - 40 min).

Contaminación, Necrosis y Supervivencia Explantes vivos, necrosados y contaminados en los tratamientos de fungicida más hipoclorito de sodio 0.5% - 40 min.

Supervivencia Explantes vivos en los tratamientos con hipoclorito de sodio y en los tratamientos con fungicida más hipoclorito de sodio 0.5% - 40 min.

Etapa IV: Incubación Yema apical de balsa con aparecimiento de brote Yema apical de balsa con aparecimiento de callo

Tratamientos de inducción Tratamientos para inducción de brotes

Formación de callo y aparecimiento de brote Formación de brote vs. aparecimiento de callo en los tratamientos de inducción para yemas de Ochroma lagopus; tratamiento 1 (BAP 0.1 mg/L), tratamiento 2 (BAP 0.2 mg/L), tratamiento 3 (BAP 0.3 mg/L), tratamiento 4 (BAP 0.4 mg/L), tratamiento 5 (BAP 0.5 mg/L).

Etapa V: Multiplicación 1 2 3 4 Conteo número de brotes que contiene cada explante.

Etapa V: Multiplicación Explantes en etapa de multiplicación (a) BAP, (b) TDZ (b)

Multiplicación Tratamientos para multiplicación utilizando BAP en combinación con ANA, nueve tratamientos más un testigo.

BAP vs. ANA Formación de brotes en los tratamientos de multiplicación para Ochroma lagopus, utilizando combinaciones de BAP y ANA.

Formación de brotes BAP vs. ANA   Porcentaje de formación de brotes en los tratamientos de multiplicación en los que se utilizó combinaciones de BAP vs. ANA.

Longitud del explante BAP vs. ANA Longitud promedio de los explantes medidas en (mm), obtenidas de los tratamientos de multiplicación en los que se utilizó combinaciones de BAP vs. ANA.

Porcentaje de longitud del explante BAP vs. ANA Porcentaje de la longitud de los explantes, obtenidas de los tratamientos de multiplicación en los que se utilizó combinaciones de BAP vs. ANA.

Longitud de brotes BAP vs. ANA Análisis de varianza para la longitud de los brotes usando combinaciones de hormonas: BAP vs. ANA

Longitud de explantes BAP vs. ANA Longitud promedio de los explantes, obtenidas de los tratamientos de multiplicación en los que se utilizó combinaciones de BAP vs. ANA.

Formación de brotes BAP vs. ANA Tabla de contingencia para la formación de brotes usando combinaciones de hormonas: BAP vs. ANA

Multiplicación   Tratamientos para multiplicación utilizando TDZ en combinación con ANA, nueve tratamientos más un testigo.

Brotes TDZ vs.ANA Formación de brotes en los tratamientos de multiplicación para Ochroma lagopus, utilizando combinaciones de TDZ y ANA.

Brotes TDZ vs.ANA Porcentaje de formación de brotes en los tratamientos de multiplicación en los que se utilizó combinaciones de TDZ vs. ANA.

Brotes TDZ vs. ANA Tabla de contingencia para la formación de brotes usando combinaciones de hormonas: TDZ vs. ANA

Longitud de Brotes TDZ vs.ANA Longitud promedio de los explantes medidos en (mm), obtenidos de los tratamientos de multiplicación en los que se utilizó combinaciones de TDZ vs. ANA.

Longitud de Brotes TDZ vs.ANA Porcentajes de la longitud de los explantes, obtenidos de los tratamientos de multiplicación en los que se utilizó combinaciones de TDZ vs. ANA.

Longitud de brotes TDZ vs. ANA Longitud promedio de los explantes, obtenidos de los tratamientos de multiplicación en los que se utilizó combinaciones de BAP vs. ANA .

Longitud de brotes TDZ vs ANA comparado con BAP vs ANA

Formación de brotes TDZ vs ANA con BAP vs ANA

Etapa VI: Enraizamiento Enraizamiento de plántulas de balsa

Conclusiones

El tratamiento fitosanitario aplicado a las plántulas de Balsa previa su introducción es determinante para reducir la contaminación en condiciones in vitro; la aplicación de 0,1% de óxido cuproso con aplicaciones mensuales cada tres días. La desinfección mecánica que consistió en retirar los primordios foliares del tejido meristemático de la zona apical y la remoción de los tricomas que recubrían el material a introducir contribuyo a mejorar la desinfección. El mejor tratamiento de desinfección para las yemas apicales de Balsa (Ochroma lagopus) fue el tratamiento 14: Captan 0,1% -Óxido cuproso 0,1%- Azoxystrobin; Difenoconazol 0,3%, (15 min) más la solución de hipoclorito de sodio: 0,5% de concentración y 40 minutos de inmersión, obteniendo el promedio más bajo tanto en contaminación como en necrosis y el mejor promedio con relación a la supervivencia. La adición al medio de cultivo de sulfato de adenina 0,5 mg/L; L – Cisteína 30 mg/L; ácido ascórbico 30 mg/L; Carbón activado 200 mg/L al medio de cultivo contribuyo a la reducción del proceso de oxidación de los explantes de Balsa en la etapa de establecimiento.

La mejor combinación de citoquinina vs La mejor combinación de citoquinina vs. auxina para la elongación de brotes fue: BAP vs. ANA (BAP 1 mg/L – ANA 0,2 mg/L) con una altura promedio de 31, 32 mm por cada repetición comparada con TDZ vs. ANA (TDZ 2 mg/L – ANA 0 mg/L) en donde se obtuvo una altura promedio de 23,68 mm por cada repetición. La mejor combinación de citoquinina vs. auxina para la obtención de brotes fue: TDZ vs. ANA (TDZ 1 mg/L – ANA 0 mg/L); con 23 brotes en promedio por cada repetición comparada con BAP vs. ANA (BAP 0,2mg/L – ANA 0,1 mg/L) en donde se obtuvo 7 brotes en promedio por cada repetición.

recomendaciones

Aplicar un rango más amplio al evaluar citoquinina vs Aplicar un rango más amplio al evaluar citoquinina vs. auxina en la etapa de multiplicación de yemas apicales de Balsa, para poder determinar de mejor forma la concentración adecuada para la etapa de multiplicación en la especie. Utilizar la información generada en esta investigación para la introducción in vitro de especies leñosas, y de esta forma contribuir en la reducción de la contaminación y la necrosis, y por su puesto poder preservar especies de importancia comercial así como las que se encuentren en peligro de extinción.

Laboratorio de Cultivo de Tejidos GRACIAS Laboratorio de Cultivo de Tejidos