“Efecto de la interacción de hongos micorrícicos arbusculares y Pseudomonas fluorescens sobre el desarrollo y la nutrición de plántulas de tomate de árbol (Solanum betaceum) durante las primeras fases de crecimiento” Elsa Echeverría Junio, 2012

Justificación del problema INTRODUCCIÓN Justificación del problema Especie frutal de gran aceptación en el mercado nacional e internacional Calidad organoléptica y por sus propiedades medicinales AGRICULTURA SOSTENIBLE RIZÓSFERA PLANTA PGPR Pseudomonas fluorescens HMA Falta de tecnificación en el cultivo Uso inadecuado de fertilizantes Pérdidas económicas a los fruticultores y graves consecuencias ambientales Métodos biotecnológicos que mejoren del rendimiento y calidad de producción Aportan en la nutrición y protección vegetal Frutos de calidad libres de contaminantes

Objetivos Específicos Objetivo General Evaluar la interacción entre hongos micorrícicos arbusculares (HMA) y rhizobacterias Pseudomonas fluorescens en el desarrollo y la nutrición de plántulas de tomate de árbol durante las primeras fases de crecimiento. Objetivos Específicos Identificar esporas de hongos micorrícicos arbusculares (HMA) en las zonas con cultivos de tomate Propagar los hongos micorrícicos arbusculares (HMA) en plantas huésped de avena. Aislar, identificar y propagar rizobacterias: Pseudomonas fluorescens, asociadas al cultivo. Establecer las concentraciones adecuadas de HMA y P. fluorescens para la aplicación de los inóculos en plantas de tomate de árbol, según el diseño experimental a utilizarse. Aplicar los inóculos de hongos micorrícicos arbusculares y de Pseudomonas fluorescens en plántulas de tomate de árbol. Evaluar la población de esporas, el % de colonización micorrícica y la población bacteriana de P. fluorescens en raíces y rizósfera presentes en las plantas de tomate de árbol. Determinar el porcentaje de supervivencia y el desarrollo de las plantas (altura, área foliar, biomasa aérea y radical) Evaluar la nutrición de las plantas mediante la capacidad de absorción de macro y microelementos en todos los tratamientos. Determinar el contenido de nutrientes del sustrato utilizado en todos los tratamientos.

Marco teórico Cultivo de tomate de árbol Planta arbustiva de la familia Solanácea. Raíz profunda, tallo cilíndrico suculento → semileñoso , hojas cordiformes Flores en forma de racimo y frutos bayas con epidermis lisa y brillante Pulpa agridulce País → provincias de Imbabura, Pichincha, Cotopaxi, Tungurahua y Azuay Clima templado a frío, T°14y 20ºC, Hr 60-80% suelos buen drenaje, ↑ cont. de MO y pH 5-7 INIAP, 2004, Soria, et al., 2008 Hongos micorrícicos arbusculares (HMA) Simbiosis entre las raíces de las plantas y hongos específicos del suelo. Micelio intracelular: formado por arbúsculos y vesículas Micelio extrarradical: red de hifas que se extienden a través del suelo formando esporas y esporocarpos Pseudomonas fluorescens Rizobacterias Promotoras del Crecimiento Vegetal Capacidad para colonizar la raíz, sobrevivir y multiplicarse en microhábitats y capacidad para promover dicho desarrollo Hábitat → suelo, agua y alimentos putrefactos MHB (Bacterias que ayudan a la micorrización) )

Mecanismos de acción de los HMA y Pseudomonas fluorescens Reguladores de crecimiento vegetal: AIA, giberelinas Inducción de resistencia sistémica Antibiosis: 2,4 DAPG y HCN Producción de sideróforos: pioverdinas Capacidad de solubilizar fósforo Aumentan la absorción de agua y nutrientes Protección frente al ataque de patógenos radicales Estimulan a microorg. simbióticos en la rizósfera Restauran la fertilidad del suelo Tolerancia a factores ambientales extremos

Desarrollo y colonización de los HMA y P. fluorescens Fases: presimbiótica y simbiótica HMA suplementarán a la planta de agua y nutrientes y la especie vegetal le proveerá de carbohidratos aprox.20% Pseudomonas sp. → degradar paredes celulares y la laminilla media entre las células de la corteza de la raíz → faciliten la penetración del HMA

MATERIALES Y MÉTODOS Selección y recolección de muestras de rizósfera Procesamiento de muestras para el aislamiento e identificación de HMA Técnica de tamizado húmedo y decantación propuesta por Gerdeman y Nicholson, 1963, modificada por Herrera et al., 2004. Técnica estandarizada por Phillips and Hayman, 1970 Muestreo en forma de zig-zag en diez puntos del terreno Propagación de esporas de HMA Se seleccionó el sitio de muestreo con > N°de esporas → multiplicaron en plantas de avena (3 meses) Recolección 500g de suelo con raíces adheridas

Aislamiento e identificación de Pseudomonas fluorescens Oxidasa Tinción Gram Medio TSI Bacterias observadas bajo luz UV 254nm Licuefacción gelatina Bacterias en medio Agar F Bacterias en medio TSA Catalasa Agar Pseudomonas Isolation Kit API 20 NE Red. de nitratos Crec. a 4ºC y 42ºC L-Arginina Acetamida Selección de 3 cepas de P. fluorescens por capacidad de solubilizar fosfato Tabla 1. Selección de las cepas de P. fluorescens solubilizadoras de fosfato inorgánico en el medio Agar Pikovskaya. CEPA P.fluorescens IS (3er día) IS (5to día) IS (7mo día) Solubilización Z5P6 4,8 a 6,6 a 6,97 a ++ Z5P5 4,5 a 4,7 ab 6,5 a Z2P6 3,53 ab 3,77 bc 4,47 ab Z5P7R 2,93 b 2,97 bc 3,33 b + Z4P1 2,9 b 2,33 c 2,4 b Z3P1 2,6 b 3,13 bc 3,2 b Z5P1 2,3 b 2,67 bc 3 b Z4P1R 2,8 bc Letras distintas indican diferencias significativas(p≤ 0,05) Medio Pikovskaya’s Agar (CONTROL) Halo de solubilización alrededor de la colonia Z5P6 tuvo >sinergismo con los HMA Producción de ácidos orgánicos (acético, oxálico y succínico) Paredes- M. y Espinosa-V., 2010

Establecimiento del diseño experimental DCA con arreglo factorial de 2 x 7, que consta de los siguientes factores y niveles: Factor 2: dosis de inóculo de Pseudomonas fluorescens: B0: sin inóculo bacteriano (0 UFC/ml) B1.1: Cepa 1 (Z2P6) en una conc. de 1.50E+08 UFC/ml B1.2: Cepa 1 (Z2P6) en una conc. de 6.00E+08 UFC/ml B2.1: Cepa 2 (Z5P5)en una conc. de 1.50E+08 UFC/ml B2.2: Cepa 2 (Z5P5) en una conc. de 6.00E+08 UFC/ml B3.1: Cepa 3 (Z5P6)en una conc. de 1.50E+08 UFC/ml B3.2: Cepa 3 (Z5P6)en una conc. de 6.00E+08 UFC/ml Factor 1: dosis de inóculo de micorrizas: M0: 0 gramos de inóculo HMA M1: 180g de inóculo (1,09 esp/g) 14 Tratamientos Aplicación de inóculos de HMA y Pseudomonas fluorescens Plántulas de tomate de árbol fueron infectadas con 180g de inóculo (que contenía 655 esporas de HMA) →1,09esp/g de suelo en c/u. Después de 30 días se colocaron tres cepas de P. fluorescens: Z2P6, Z5P5 y Z5P6 en dos concentraciones 1.5x108 y 6.0x108UFC/ml

RESULTADOS Y DISCUSIÓN Propagación de esporas de HMA del muestreo de cultivos de tomate de árbol Muestreo en las Provincias de Cotopaxi, Pichincha y Tungurahua Suelo de Panzaleo (Cotopaxi) con >N° de esporas 0,87esp/g 3 meses Fertilizantes→ Afectando la [ ] y biodiversidad microbiana en la rizósfera (Ogata, K. y Zuñiga D., 2008). 3,64esp/g de suelo y con un porcentaje de colonización 48%. Figura 1. Densidad de esporas de HMA/g de suelo presente en las muestras de tomate de árbol Densidad poblacional de Pseudomonas sp. en las cinco zonas muestreadas Densidad bacteriana entre 104 y 105UFC/g de raíces y suelo seco Bajsa, N., 2008 103 a 106 UFC/g en suelos de ≠ orígenes Figura 2. Densidad poblacional de P.fluorescens en raíces y rizósfera del tomate de árbol

Conteo de esporas y porcentaje de colonización Conteo de la densidad poblacional de P.fluorescens de raíces y rizósfera Conteo de esporas y porcentaje de colonización Trat. Esporas/g de suelo % de Colonización M1_B0 17,63 a 61,33 a M1_B3.1 14,20 b 60,67 a M1_B3.2 9,63 d 56,00 ab M1_B2.1 10,23 cd 52,33 c M1_B2.2 9,50 d 41,67 cd M1_B1.1 10,40 c 45,67 c M1_B1.2 8,33 e 36,00 d M0_B3.1 0,07 f 0,33 e M0_B3.2 0 f 0 e M0_B2.1 M0_B2.2 0,03 f M0_B1.1 M0_B1.2 M0_B0 Trat. UFC/g raíces UFC/g suelo M0_B3.2 1,6E+05 2,2E+05 M0_B3.1 1,0E+05 1,8E+05 M0_B2.2 1,1E+05 1,4E+05 M0_B2.1 9,6E+04 M0_B1.2 2,1E+05 M0_B1.1 9,4E+04 M1_B3.2 1,5E+05 M1_B3.1 M1_B2.2 6,5E+04 M1_B2.1 6,1E+04 8,4E+04 M1_B1.2 1,2E+05 M1_B1.1 7,6E+04 M1_B0 0,0E+00 2,7E+03 M0_B0 1,4E+03 DB 104 y 105 UFC/g en raíces y suelo Tabla 2. Conteo de esporas y % de colonización al finalizar el ensayo. Tabla 3. Densidad poblacional en raíces y rizósfera al finalizar el ensayo. Kumar Choudhary y otros, 2009 un nivel de colonización óptimo de Pseudomonas sp. → 105 y 106UFC/g de raíces.

Biomasa aérea fresca (g) Biomasa radical fresca (g) Evaluación del desarrollo y nutrición de las plantas de tomate de árbol (Solanum betaceum) Tabla 4. Efecto de la inoculación simple y combinada de los HMA y las cepas de P. fluorescens sobre el desarrollo del tomate de árbol. Tratamientos Altura (cm) Área foliar (cm2) Biomasa aérea fresca (g) Biomasa radical fresca (g) M1_B3.2 18,70 a 65,88 a 12,07 a 8,93 a M1_B3.1 18,41 ab 63,10 a 11,42 a 8,75 a M1_B2.2 17,83 abc 56,90 a 11,00 a 8,52 a M1_B2.1 17,14 abc 64,30 a 10,99 a 8,26 a M1_B1.2 16,30 abc 61,26 a 10,92 ab 7,78 ab M1_B1.1 15,46 c 57,40 a 10,34 ab 7,36 ab M1_B0 16,10 bc 60,22 a 11,12 a 8,59 a M0_B3.2 10,22 de 32,89 bc 6,71 c 4,20 cd M0_B3.1 11,33 d 40,89 b 8,42 bc 5,69 bc M0_B2.2 9,54 de 27,33 bc 6,14 c 4,30 c M0_B2.1 10,31 de 28,67 bc 6,07 c 4,38 c M0_B1.2 10,42 de 25,56 c 6,97 c 4,24 c M0:B1.1 10,33 de 6,73 c 4,52 c M0_B0 8,57 e 19,42 c 3,32 d 1,99 d = resultados por Cuesta y colaboradoes, 2004 → inoculación doble de P. fluorescens y Glomus mosseae en plantas de Swietenia macrophylla.

Altura Staley y colaboradores, 1992→ P. fluorescens y HMA en plantas de alfalfa y trébol incrementaron en 23% h respecto a las plantas control. Tratamiento M1B3.2 presenta la media muestral > en altura Figura 3. Efecto de la interacción simple y combinada entre los HMA y la cepa Z5P6 de P. fluorescens sobre la altura de las plantas de tomate de árbol.

Área foliar Figura 4. Efecto de la interacción simple y combinada entre los HMA y la cepa Z5P6 de P.fluorescens sobre el área foliar de las plantas de tomate de árbol.

Biomasa aérea y radical Cuesta y colaboradoes,2004→ inoculación doble de P. fluorescens y Glomus mosseae en plantas de Swietenia macrophylla Co-inoculación mejoró significativamente en peso seco radical y aéreo de las plántulas Figura 5. Efecto de la interacción entre HMA y cepa Z5P6 sobre la biomasa aérea y radical de las plantas de tomate de árbol.

Análisis de nutrientes a nivel foliar Nivel normal (0,15 y 0,40%) Nivel normal (2,5 y 6,0%) Figura 6. Efecto de la interacción entre los HMA y la cepa Z5P6 sobre la absorción de fósforo Figura 7. Efecto de la interacción entre los HMA y la cepa Z5P6 sobre la absorción de nitrógeno Barea et. al., 1983→ P liberado en el suelo por P. fluorescens serían absorbidos por los HMA, que posteriormente lo harán disponible para la planta = resultados Chamizo, A. y colaboradores , 2009 →inoculación doble entre Glomus sp. y P. aeruginosa mejoraron el contenido de N en alfalfa

Análisis de nutrientes a nivel suelo Tabla 5. Análisis de nutrientes en el suelo de los tratamientos del ensayo Trat. pH M.O. % P (ppm) NO3 (ppm) Mg (meq/ml) Cu (ppm) Zn (ppm) B (ppm) M0_B0 6,4 13,63 3,3 49,2 2,21 2,5 3,9 0,76 M0_B1.1 14,98 2,8 55,4 2,44 2,3 3,1 0,77 M0_B1.2 6,3 11,33 3,2 56,1 2,37 2,1 3,5 M0_B2.1 6,2 14,03 54,6 2,47 2,4 3,6 0,83 M0_B2.2 11,39 57,7 2,15 M0_B3.1 6,5 14,16 4 32,4 2,7 3,8 0,78 M0_B3.2 10,96 4,3 45,4 2,36 1,9 3,4 0,68 M1_B0 6,7 5,48 66 27 3,07 5,2 1,2 M1_B1.1 8,04 47 30,8 3,13 7,1 1,21 M1_B1.2 7,82 62 23,2 2,66 4,8 1,22 M1_B2.1 6,6 6,42 52 24,7 3,31 8,6 M1_B2.2 6,9 7,6 57,2 1,17 M1_B3.1 5,56 63,4 37,7 2,98 5,8 1,14 M1_B3.2 7,69 64 29,3 3,09 5,7 1,31 RANGO NORMAL Neutro 2,0-40 7-100 70-170 0,33-8,0 1,0-6,0 3,0-9,0 1,0-4,0 Russell, E. y Wild, Alan, 1992 → necesario en el estado nutricional de las plantas adultas

CONCLUSIONES Inóculo aplicado fue de 3,64esp/g, después de 4 meses de ensayo se obtuvo en las plantas micorrizadas 17,63 esp/g y 61,33% y en las co-inoculadas de 14,20 esp/g y 60,67%.    DB de Pseudomonas sp. en las 5 zonas muestreadas variaron 104 y 105 UFC/g de raíces y suelo Cepas : Z2P6, Z5P5 y Z5P6 se colocaron en dos conc: 1,5x108 y 6,0x108UFC/ml, al finalizar el experimento se obtuvo una DB entre 104 y 105 UFC/g de raíces y entre 103 y 105 UFC/g de suelo seco. 90% de supervivencia, aquellas co-inoculadas con HMA y la cepa Z5P6 de P. fluorescens (en conc. de 6,0x108UFC/ml) presentaron el mejor crecimiento del tomate de árbol, aumentando h en 1 vez, af en 2, ba y br en 3 veces respecto los controles. Las plantas micorrizadas y co-inoculadas con HMA y P. fluorescens cepa Z5P6 evidenciaron una mayor absorción de los nutrientes fósforo y nitrógeno El sustrato de las plantas micorrizadas y co-inoculadas alcanzaron niveles normales de P y Mg; el NO3 fue deficiente en todos los tratamientos, sin embargo fue > en los tratamientos micorrizados Cu, Zn y B presentes en el suelo estuvieron dentro de los rangos óptimos para el desarrollo del tomate de árbol

RECOMENDACIONES Ensayos a nivel de invernadero con mayor número de repeticiones por tratamiento, para verificar si existe un incremento significativo en las variables de crecimiento de las plantas con interacción entre los HMA y la cepa Z5P6 de P.fluorescens.   Medir las variables de producción del cultivo (rendimiento) a nivel de campo para determinar los beneficios de la aplicación de estos microorganismos promotores del crecimiento vegetal. Evaluar la contribución de los microorganismos (HMA y P. fluorescens) en el control biológico de patógenos radicales (nemátodos) y del filoplano (Colletotrichum gloeosporioides) del cultivo de tomate de árbol. Determinar la producción del compuesto 2,4DAPG en las cepas de P.fluorescens aisladas del cultivo en estudio. Identificar las especies de HMA que formaron el consorcio aplicado en el ensayo, a fin de probar el comportamiento en forma independiente o en interacción con P.fluorescens sobre el desarrollo y nutrición de las plantas de tomate de árbol.

GRACIAS…