v = c/l E = hv
S2 S1 Energía S0 Diagrama de Jablonski Conversión interna (10-12 s) Absorción (10-15 s) Fluorescencia (10-9 s-10-8 s) Nr S0 Corrimiento de Stokes : emisión > absorción
Relajación del solvente Diagrama de Jablonski Conversión interna S2 Relajación del solvente (10-10 s) (10-12 s) S1 Energía Absorción (10-15 s) S0 Corrimiento de Stokes : emisión > absorción
Absorción G relajación térmica relajación térmica Fluorescencia
Quantum yield
Tiempo de vida
Quenching the fluorescencia Puede ser estático o dinámico
Resonance Energy Transfer
FLUORÓFOROS INTRÍNSECOS Triptofano es el fluoróforo intrínseco dominante. Trp es muy sensible al entorno. Es posible ver cambios en los espectros de emisión en respuesta a cambios conformacionales, asociación de subunidades, unión de sustratos, desnaturalización y cualquier cosa que afecte el entorno local del anillo indol. Trp es muy sensible a la atenuación colisional, tanto por grupos externos como por grupos vecinos, en la proteína. Trp puede ser excitado selectivamente a 295 nm. (para evitar la excitación de la Tyr).
Trp 48 Azurina 4AZU max= 308nm Trp 48 Proteína G max= 342.5 nm Trp 25 Glucagon 1GCN max 350.8 nm
Fluoróforos extrínsecos * fluorescencia (no polar) absorción _ + et Transferencia electrónica S1 ct S0 np (estable en ambiente polar) fluorescencia (ambiente polar) S1 (no polar) Variación en el rendimiento cuántico del ANS
U ESβL9 (5 M GdmCl) IP ESβL9 N ESβL9 (0.05 M GdmCl) N-terminal C-terminal Esquema de la estructura de la ‑lactamasa. Se muestran las hélices C y N terminales.
Longitud de onda Fluorescencia