Capacidad de unión lipídica de la Hemocianina en arañas Integrantes: Faura, Solange Luna, Julia Zúñiga, Emiliano

Hemocianina Pigmento respiratorio de invertebrados. Primer reporte de Hemocianina unida a lípidos por Zatta (‘81) en Carcinus maenas, con supuesta función estabilizadora de la estructura proteica.

En trabajos posteriores con Octopus tehuelchus se sugirió la posible función de la hemocianina como apolipoproteína. Se encontraron tres lipoproteínas (VHDL, HDL y LDL) que contenían Hemocianina.

En Ampullaria canaliculata se encontraron abundantes concentraciones de Hemocianina asociadas a pequeñas cantidades de lípidos.

En arácnidos se estudiaron tres especies: Eurypelma californicum, Polybetes pythagoricus, Latrodectus mirabilis. Tomando como objeto de estudio P. pythagoricus se procedió a aislar la lipoproteína, extraer los lípidos y reconstituir la misma con distintos lípidos para medir la capacidad de unión con cada uno de ellos.

Materiales y métodos Aislamiento de la fracción lipoproteica de la hemolinfa Ultracentrifugación plasmática en gradientes de densidad. Se agregó un inhibidor de proteasas (TRASYLOL) con NaBr. Centrifugación 178.000 g durante 24 Hs. Separación en alicuotas de 0.3 ml. Monitoreo por espectrofotometría a 280 nm.

Deslipidación y reconstitución de la fracción lipoproteica Se deslipida el VHDL con Triton-X-100, 0,02 gr/gr de proteína. Se incuba a temperatura ambiente durante una hora, con agitación. Se elimina el detergente. La fracción sin lípidos se extrae con solventes orgánicos. Se analiza por TLC-FID, para corroborar la ausencia total de lípidos.

Se reconstituyen las fracciones de lipoproteína con lípidos marcados radioactivamente con C14. Acido Palmítico Fosfatidilcolina Colesterol Trioleina

Separación cromatográfica de la fracción marcada y cuantificación de los lípidos unidos a la hemocianina Las muestras reconstituidas se analizaron con HPLC (Cromatografía líquida de alta resolución) empleando columnas de exclusión molecular. Las fracciones eluidas se analizaron en cuanto a su contenido: - Lipídico mediante radiactividad (medidas con un Cocktail de Centelleo Líquido). - Proteico mediante espectofotometría a 280nm.

Resultados: El análisis de la espectrofotometría dio lugar a un gráfico donde se pueden apreciar 3 picos en los valores de absorbancia.

Se observaron tres subfracciones de la hemocianina correspondientes a: I) Heptámeros II) Hexámeros III) Monómeros Se separó la fracción de mayor absorbancia, que contiene VHDL, la cual presenta la mayor concentración de Hemocianina. Con el análisis de TLC-FID se confirmó que no se presentan lípidos en la fracción proteica.

Cuando se incrementan las cantidades de lípidos incubados con cantidades constantes de hemocianina deslipidada, se observan diferentes proporciones de lípidos unidos a la proteína, tendiendo a una relación hiperbólica.

La proporción molar máxima (Mr) entre lípido/Hemocianina, se obtuvo en la fracción de ácido grasos libes (ácido palmítico). La proporción molar mínima (Mr) entre lípido /Hemocianina se obtuvo en la fracción de Trioleina (Triacilgliceroles).

Los valores más bajos de la constante de disociación (Kd) se obtuvieron en la fosfatidilcolina y en el colesterol. Los valores más altos de efectividad máxima de unión inicial lípido/proteína (Eo), se obtuvieron en el colesterol y fosfatidilcolina. Los valores de Eo son inversamente proporcionales a los valores de Kd.

La proporción molar lípido/proteína in vitro en todos los casos fue mayor que la encontrada bajo condiciones fisiológicas.

Hemocianina nativa tiene una estructura dihexamérica. Esta puede perderse por cambios en el PH, concentraciones de cationes divalentes y el NaBr (Ultracentrifugación). De las tres subfracciones de Hemocianina, solamente la hexamérica es similar a la estructura nativa y es capaz de unir lípidos in vitro. En su estructura existen dominios de baja polaridad que son capaces de interactuar con lípidos. Se presentan zonas hidrofóbicas que producen la gradual saturación de los sitios de unión a lípidos, generando así la relación hiperbólica antes mencionada.

Bajo condiciones de saturación con colesterol y cantidades variables de fosfatidilcolina, se llega a un reemplazo equilibrado entre ésta y el colesterol.

Mediante este trabajo se confirmó que la hemocianina es la apolipoproteína de unión de lípidos de VHDL.

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Posible trabajo posterior Determinar el por qué de las variaciones entre PMR y Mr/PMR. Estudiar la posible variación de la unión de lípidos a hemocianina bajo fluctuaciones en el nivel de Oxígeno. Cómo varía la proporción molar lípido/hemocianina en diferentes condiciones estacionales y diferentes estadios del desarrollo.

GRACIAS!!!!!