Ácido ferúlico Eugenol Acido vainíllico Acido siríngico CH2 CH CH2 COOH HC CH OCH3 OH OCH3 OH Acido vainíllico COOH Acido siríngico COOH OCH3 OH H3CO OCH3 OH Acido verátrico Vainíllina Guaiacol CHO COOH OCH3 OCH3 OCH3 OH OCH3 OH

Ruptura del anillo aromático Ruptura intradiólica u orto OH COOH OH COOH Ruptura extradiólica o meta OH OH OH COOH CHO

pcaU pcaIJFBDKCHG quiBCXA pobSR pobA Protocatecuato Catecol OH OH pcaHG protocatecuato dioxigenasa catA catecol 1,2-dioxigenasa OH OH Protocatecuato -O2C Catecol CO2 pcaB B-carboxy-cis,cis muconato lactonizante CO2 catB cis,cis muconato lactonizante CO2 CO2 Carboxymuconato -O2C Muconato CO2 CO2 O O C=O C=O g -Carboxymuconolactona Muconolactona pcaC g-carboxymuconato decarboxilasa catC muconato isomerasa CO2 O C=O b-Ketoadipato-enol-lactona pcaD, catD b-Ketoadipato-enol-lactona hidrolasa O CO2 CO2 b-Ketoadipato pcaIJ, catIJ b-Ketoadipato-succinil-CoA transferasa O O CSCoA CO2 b-Ketoadipil-CoA pcaF, catF b-Ketoadipil-CoA tiolasa Succinil-CoA+Acetil-CoA

Eugenol Coniferol alcohol Eugenol hidroxilasa Eugenol hidroxilasa CH2 CH CH2 CH CH CH2 CH2 CH CH2OH OCH3 Eugenol hidroxilasa OCH3 Eugenol hidroxilasa OCH3 OH O OH Coniferol alcohol deshidrogenasa Ácido ferúlico COOH Coniferol aldehído HC CH2 CH COH Coniferol aldehído deshidrogenasa CH OCH3 OCH3 OH OH

PMSox. Eugenol +H218O ½H2O e- e- e- Citocromo oxidasa 18O-Coniferol alcohol (Flavina) ? Citocromo c a H2O b PMSred. Eugenol Coniferol alcohol CH2 CH CH2 CH2 CH CH2OH ehyA/B OCH3 OCH3 OH OH

Pseudomonas sp. OPS1 Pseudomonas sp. HR199 ehyA OPS1 ehyB OPS1 HR199 eugR ORF2 ehyB azu Pseudomonas sp. OPS1 ehyA ORF2 ehyB Pseudomonas sp. HR199 ehyA OPS1 ehyB OPS1 HR199 57% 85% p-cresol metil hidroxilasa (P. putida) 34% 54%

4-Hidroxi-benzil-alcoholes La actividad se mide por los cambios en absorbancia a 600nm que se producen por la reducción de DCPIP (2,6 diclorofenol-indofenol) en presencia del sustrato y la enzima y PMS (fenazina metosulfato) Pseudomonas fluorescens E118 Sustrato Actividad(%) Producto CH2 CH CH2OH OCH3 OH CH2 CH CH3 OH Eugenol p-cresol 4-etilfenol 4-n-propilfenol 4-isopropilfenol 4-n-butilfenol 4-sec-butilfenol 4-n-hexilfenol 4-n-octilfenol 4-hidroxibenzilalcohol Vanillil-alcohol 100 8 78 73 6 66 12 38 14 122 99 Coniferil-alcohol 4-hidroxibenzaldehído 1-(4-hidroxifenil)etanol 1-(4-hidroxifenil)propanol 2-(4-hidroxifenil)propane-2-ol 1-(4-hidroxifenil)butanol 2-(4-hidroxifenil)butane-2-ol 1-(4-hidroxifenil)hexanol 1-(4-hidroxifenil)octanol Vainillina OCH3 CH2OH OH OH R OH R OH OH Alquil-fenoles R=alquil C1- C7 CH2OH CHO R R OH OH 4-Hidroxi-benzil-alcoholes R=OMe ó H

Degradación de ácido ferúlico Hay propuestas cinco rutas de degradación: 1.- Decarboxilación de la cadena lateral con formación del 4-hidroxi-3-metoxiestireno 2.- Reducción del ácido ferúlico 3.- Ruptura dependiente de coenzimaA, por ruta no b-oxidativa 4.- Ruptura dependiente de coenzimaA, por ruta b-oxidativa 5.- Ruptura por desacetilación para producir directamente vainillina COOH HC CH OCH3 OH

Depósitos de disolventes 1 2 3 Sistema de gradiente Sistema de Control de temperatura Cámara mezcla Indicador de presión Sistema de bombeo a presión Colector de fracciones Sistema de inyección Supresor pulsos Control caudal Detector contínuo Columna Impresora Registrador

B. coagulans BK07 Bacillus coagulans BK07 Bacillus pumilus UI-670 Lactobacillus plantarum Bacillus subtilis

1.- Decarboxilación de la cadena lateral con formación del 4-hidroxi-3-metoxiestireno COOH HC CO2 CH CH=CH2 CHO decarboxilación OCH3 OCH3 OCH3 OH OH OH Acido ferúlico 4-vinil-guaiacol Vainillina COOH COOH OH OCH3 OH OH Ácido protocatecuico Ácido vainíllico

2.-Reducción del ácido ferúlico COOH COOH CH2 HC CH CH2 CHO OCH3 OCH3 OCH3 2(H) OH OH OH Acido ferúlico Dihidroferúlico Vainillina Burkholderia cepacia Wolinella succiongenes Pseudomonas fluorescens FE2 COOH COOH OH OCH3 OH OH Ácido protocatecuico Ácido vainíllico

4-Hidroxi-3-metoxibenzoil 3.- Ruptura dependiente de coenzimaA, por ruta b-oxidativa Acido ferúlico Feruloil S-CoA COOH COSCoA COSCoA HC HC CH2 4-Hidroxi-3-metoxifenil- B-hidroxipropionil SCoA (HMPHP SCoA) ATP H2O CH CH CHOH CoASH OCH3 OCH3 OCH3 OH OH OH Rhodotorula rubra P. putida NAD+ NADH2 COSCoA CH2 CHO CoASH COSCoA CH3COSCoA CO OCH3 NADH+H+ CoASH OCH3 OCH3 OH OH OH Vainillina Vainilloyl SCoA 4-Hidroxi-3-metoxibenzoil acetil SCoA

Extracto+CoA/ATP +NAD+ 100 Mezcla de reacción Rendimiento relativo de vanillato Extracto+CoA/ATP +NAD+ 100 Extracto+CoA/ATP 86 Extracto+NAD+ 47 Extracto Buffer+CoA/ATP +NAD+

4.- Ruptura dependiente de coenzimaA, por ruta no b-oxidativa Acido ferúlico Feruloil S-CoA COOH COSCoA COSCoA HC HC CH2 4-Hidroxi-3-metoxifenil- B-hidroxipropionil SCoA (HMPHP SCoA) ATP Mg2+ H2O CH CH CHOH CoASH OCH3 OCH3 OCH3 OH OH OH CH3COSCoA P. fluorescens AN103 P. fluorescens BF13 P. putida WCS358 P. sp. HR199 CHO OCH3 OH Vainillina

Pseudomonas fluorescens AN103 MgCl2,CoASH,ATP sin extracto prot. MgCl2,CoASH,ATP con extracto prot. MgCl2,CoASH,ATP,NAD+ con extracto prot.

Pseudomonas fluorescens AN103

Sustrato Activ. Enzimática (nmol min-1 (mg prot)-1 Ferulato-CoA ligasa La actividad ferulato-CoA ligasa se mide viendo absorbancia a 345nm, en contraste con un blanco en el que no se incluye el CoASH La actividad vainillina oxidoreductasa se mide como disminución de absorbancia a 340nm comparando con una reaccion en la que no se añade NAD+ Activ. Enzimática (nmol min-1 (mg prot)-1 Sustrato Ferulato-CoA ligasa Vainillina Oxidoreductasa Ácido ferúlico 5800 630 Vainillina 0 460 Ácido Vainíllico 0 0 Ácido Succínico 0 0

Extracto+CoA/ATP +NAD+ 100 Mezcla de reacción Rendimiento relativo de vanillato Extracto+CoA/ATP +NAD+ 100 Extracto+CoA/ATP 86 Extracto+NAD+ 47 Extracto Buffer+CoA/ATP +NAD+

5.- Ruptura por desacetilación para producir directamente vainillina Acido ferúlico Ácido b-hidroxi-hidroferúlico Vainillina COOH COOH HC CH2 CH CHOH CHO OCH3 OCH3 OCH3 OH OH OH OCH3 COOH CH2OH OH Streptomyces setonii Pseudomonas mira Bacillus subtilis Guaiacol OCH3 OCH3 COOH OH OH Ácido vainíllico Vainillil alcohol OH OH Ácido 3,4-dihidroxybenzoic acid

Identificación de genes

4.- Ruptura dependiente de coenzimaA, por ruta no b-oxidativa Acido ferúlico Feruloil S-CoA COOH COSCoA COSCoA HC HC CH2 4-Hidroxi-3-metoxifenil- B-hidroxipropionil SCoA (HMPHP SCoA) ATP Mg2+ H2O CH CH CHOH CoASH OCH3 OCH3 OCH3 OH OH OH CH3COSCoA P. fluorescens AN103 P. fluorescens BF13 P. putida WCS358 P. sp. HR199 CHO OCH3 OH Vainillina

Pseudomonas fluorescens AN103 Activ. Enzimática Cepa Vanillato formado Ferulato-CoASH ligasa Vainillina:NAD+ oxidoreductasa nanokatals/mg prot nmol/mg prot. AN1038 (Fer+) 1,7 1,2 807 Van 1 (Fer-) 0 0,05 0 Van 10 (Fer-) 2,0 1,4 59

Pseudomonas fluorescens AN103 y BF13 78MVNGWCFGGG88 246ELGGKAPFLVLADADLE262 fca vdh Enoil-CoA hidratasa Vainillina:NAD+ oxidoreductasa COSCoA HC CH CHO COOH fca vdh OCH3 OCH3 OCH3 OH OH OH Feruloil-CoA Vainillina Ácido vainíllico

V F 97.4 66.2 45.5 31.0 21.5 14.4

Pseudomonas fluorescens AN103 Feruloil-ScoA como sustrato HMPHP SCoA como sustrato Cepa Formación de vainillina Formación de acetil-SCoA Formación de vainillina Formación de acetil-SCoA Formación de feruloil-SCoA nanokatals/mg prot E.coli JP2 1,5 1,8 1,5 1,8 3,4 E. coli JP2 (I) 1,2 1,3 1,3 1,5 3,2 P. fluorescens AN103 4,2 3,3 2,9 2,7 8,3

fca vdh ech vdh fcs fca vdh ech fcs fca vdh ech fcs Pseudomonas fluorescens AN103 Enoil-CoA hidratasa Vainillina:NAD+ oxidoreductasa ech vdh fcs P. sp. HR199 Feruloil-CoA sintetasa fca vdh P. putida WCS358 ech fcs Amycolatopsis sp. HR167 fca vdh P. fluorescens BF13 Delftia acidovorans ech fcs

fcs ech ech vdh Acido ferúlico Feruloil S-CoA 4-Hidroxi-3-metoxifenil- COOH COSCoA COSCoA HC CoASH HC CH2 4-Hidroxi-3-metoxifenil- B-hidroxipropionil SCoA (HMPHP SCoA) ATP Mg2+ H2O CH CH CHOH fcs ech OCH3 OCH3 OCH3 OH OH OH ech CH3COSCoA COOH CHO vdh OCH3 OCH3 OH OH Vainíllico Vainillina

1.- Decarboxilación de la cadena lateral con formación del 4-hidroxi-3-metoxiestireno COOH HC CO2 CH CH=CH2 CHO decarboxilación OCH3 OCH3 OCH3 OH OH OH Acido ferúlico 4-vinil-guaiacol Vainillina COOH COOH OH OCH3 OH OH Ácido protocatecuico Ácido vainíllico

Bacillus subtilis

Degradación de ácido vainíllico

Rhodotorula rubra Descarboxilación Desmetilación Guaiacol COOH OCH3 OCH3 OH Guaiacol O COOH OCH3 OH Ácido vainíllico COOH COOH OCH2OH OH OH OH Protocatecuato Desmetilación

Streptomyces sp. D7 vdcB vdcC CO2 Ácido vainíllico Guaiacol vdcD COOH OCH3 OCH3 OH OH Ácido vainíllico Guaiacol vdcB vdcC vdcD 0,6 Kb 1,4 Kb 0,2 Kb VdcB tiene homología con la fenilacritado descarboxilasa de Saccharomyces cerevisiae VdcC tiene homología con la4-hidroxibenzoato carboxi-liasa

Streptomyces lividans Streptomyces lividans Streptomyces lividans 3,5 2,5 Guaiacol Streptomyces lividans pCKS1 Vainíllico 1,5 0,5 20 40 60 3,5 2,5 Streptomyces lividans pCKS2 Concentración (mM) 1,5 0,5 20 40 60 3,5 2,5 1,5 Streptomyces lividans 0,5 20 40 60 Tiempo (hs.)

Acinetobacter sp. ADP1 pcaB Acido ferúlico Acido vainíllico -OOC HC HC OCH3 -O2C OCH3 Carboxymuconato Protocatecuato OH OH pcaB -O2C -O2C CO2 OH CO2 -OOC OH HC Metabolito tóxico HC -OOC OH OH Acido p-cumárico Acido p-hidroxibenzóico

vanR vanB vanA vanK 1Kb Acido vainíllico Protocatecuato OCH3 OH -O2C Acido vainíllico Protocatecuato OCH2OH + NAD+ + H2O + HCHO O2 + NADH + H+ + oxigenasa dependiente de 2-oxoglutarato de proteína similar a ferredoxina proteína similar a SalA proteína similar a PcaU proteína similar a VanA receptor de hierro acetil-transferasa porina vanR vanB vanA vanK 1Kb

Pseudomonas aeruginosa PAO1 Pseudomonas putida WCS358 vanR vanB vanA vanK Acinetobacter sp. ADP1 vanR vanB vanA vanK Pseudomonas aeruginosa PAO1 vanR vanB vanA abc Pseudomonas putida WCS358 Pseudomonas sp. HR199 vanB vanA vanR

{ { IA IB IIA IIB III Clase Oxigenasa Ejemplo Cadena transportadora de electrones Clase Oxigenasa Ejemplo { 4-sulfobenzoato 3,4-dioxigenasa IA 4-clorofenilacetato 3,4-dioxigenasa talato 4,5-dioxigenasa { 2-oxo-1,2 dihidroquinolina 8-monoxigenasa IB benzoato 1,2-dioxigenasa IIA dibenzofurano 4,4a-dioxigenasa benceno 1,2-dioxigenasa IIB naftaleno 1,2-dioxigenasa III [2Fe-2S]R, Fe(II) Oxigenasa (ISP) FMN, [2Fe-2S] reductasa FAD, [2Fe-2S] reductasa FADreductasa [2Fe-2S] Ferredoxina [2Fe-2S]R Ferredoxin ISP Butler et al. (1997) Advances in Microbial Physiology

Tamaño de subunidad, cofactor Enzima Tamaño de subunidad, cofactor Familia de la p-hidroxibenzoato hidroxilasa 45 kDa, FAD p-hidroxibenzoato hidroxilasa (Pseudomonas fluorescens) Salicilato hidroxilasa (NAH7) Familia de la fenol 2-hidroxilasa 65 kDa, 2-4-diclorofenol 6-monooxigenasa (pJP4) Fenol hidroxilasa (Pseudomonas EST1001) Familia multicomponente de la fenol 2-hidroxilasa 34 + 10 +58 + 10 kDa, Fe(II) Fenol 2-hidroxilasa (Pseudomonas CF600) Tolueno 4-monooxigenasa (Pseudomonas mendocina) Monooxigenasas no clasificadas o-nitrofenol hidroxilasa (Pseudomonas putida B2) 65 kDa, FAD? 4-hidroxifenilacetato 3-hidroxilasa (Pseudomonas putida) 44 kDa, FAD? 2,4-dihidroxifenilacetato monooxigenasa (pJP4) 32 kDa 3-hidroxibenzoato-6- hidroxilasa (Pseudomonas cepacia) 44 kDa, FAD 3-hidroxibenzoato-6- hidroxilasa (Micrococcus sp.) 70 kDa, FAD

Tamaño de subunidad, cofactor Enzima Tamaño de subunidad, cofactor Hidroxilasas de grupo alquilo 41 kDa, Fe(II) Familia de las alcano hidroxilasas Alcano hidroxilasa (ALK) Xileno monooxigenasa (TOL) Metano monooxigenasa (Methylosinus trichosporium) A (54+43+23 kDa) B(16kDa) Vanillato demetilasa (Pseudomonas sp.) (34 kDa)n No clasificadas 4-Metoxibenzoato monooxigenasa (Pseudomonas putida) (40 kDa)3 , Fe(II) [2Fe-2S]R Tolueno sulfonato metil-monooxigenasa (Comamonas testosteroni) (43 kDa)3, o (40 kDa)4 Familia de las citocromo P450 monooxigenasas Canfor 5-monooxigenasa (CAM) P-450 mitocondrial (Eucariotas) P-450 microsomal(Eucariotas) Citocromo P-450bm-3 (Bacillus megaterium) 120 kDa Familia de las hidroxilasas de aminoácidos aromáticos Fenil alanina-4- hidroxilasa (Eucariotas) 52 kDa Tirosina 3- hidroxilasa (Eucariotas) 59 kDa Triptofano hidroxilasa (Eucariotas) 51 kDa

VanA VanB FCPHRGAPLSLGYVEDGHLVCGYHGL DRWQRCHFFAPSNVHI Sitio de unión a hierro de tipo Rieske 100 200 300 VanA Sitio activo de unión a hierro CDYRLMIDNLMDLTHETYVHSS MLEQQQQNIV AGGTGT CEQGTCGTCITR VanB 100 200 300 Sitio de unión a NAD ribosa Sitio de unión a hierro-azufre LTRQYSL Sitio de unión a FMN

3-Hydroximetil-4-hidroxi 5-metilbenzoato -02C OH OCH3 100% -02C OH 100% Vanillate Protocatecuato -02C -02C -02C CH3 -02C CH2OH OCH3 100% 9% OH OH CH3 85% 10% OH CH3 m-Anisate m-Hydroxibenzoato 4-Hydroxi-3,5 dimetil-benzoato 3-Hydroximetil-4-hidroxi 5-metilbenzoato OCH3 -02C OH -02C OCH3 100% 22% -02C CH3 CH2OH -02C CH3 100% 5% CH3 3,4-dimetoxibenzoato Isovanillato 3,4-dimetilbenzoato 3-hidroximetil, 4-metilbenzoato -02C CH3 CH2OH -02C OCH3 -02C 70% 0% OH -02C OCH3 100% 7% m-toluato 3-hidroximetilbenzoato OCH3 3,4,5-trimetoxibenzoato 3-hidroxi, 4,5-dimetoxibenzoato

vanA vanB vanA673 vanA675 vanA653 vanA6450 vanA647 vanA675 vanA657 ATTGATGCTGAATATCGATGCTGGCGGGGT 50pb del Tn10 TGCTGAATA 960 970 vanA675 TGCGCAGCG GCTATGCC TGTAGGCGGCTTCCCC 250 260 270 vanA TAACTGTTGTAGTGAACAACATCGCTATGTG Tn5613AAC 1250 1260 1270 vanA647 AACACTTCCC? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? Tn5613? ? ? ? vanA675 1550 IS1236?AAC vanA657 CAACAACTGACCGACCAGATTCGTGAAGGACAA IS1236? AGA 870 860 850 vanA6450 ATTGATGCTGAATATCGATGCTGGCGGGGT ATTGATGCTGD D D D D D D D D D D D D D D DCGGGGT vanA653 960 970 vanB AGGCATTTGCGGCACCTGTATTA A vanA649 1890 1900

vanR vanB vanA vanK Acinetobacter sp. ADP1 3 2 1 4 6 8 Wild-type VanR- Concentración metabolito (mM) 4 6 8 Tiempo (h) Wild-type VanR- Protocatecuato Vanillato

vanR vanB vanA vanK wt/ni c e wt/i R-/ni

CH3-FH4 3 3CO2 6[H] 3CO 3CH3-FH4 CO2 3acetil-CoA 3CH3-COO- [CoIII]-CH3 FH4 Protocatecuato MTI MTII -02C OH OCH3 CH3-FH4 [CoI] Vanillate AE [CoII] e- e-+ATP -02C OH OCH3 -02C OH OCH3 CH3-FH4 3 3CO2 6[H] 3CO 3CH3-FH4 CO2 3acetil-CoA 3CH3-COO-

Dqui, DpcaBCK1 Dqui, DpcaBCK1 Mb. externa Periplasma VanK PcaK Protocatecuato Quinato -O2C OH Periplasma HO OH -O2C OH OH OH QuiA QuiC HO O QuiB -O2C O QuiA -O2C OH -O2C OH OH OH OH OH OH Dehidroquinato Dehidrosiquimato Siquimato VanK PcaK Mb. interna Dehidroquimato Dehidrosiquimato Siquimato Citoplasma Fosfoenolpiruvato + eritrosa 4-fosfato Aminoácidos aromáticos Corismato Dqui, DpcaBCK1 T= 0 hs. ADP1 DpcaK DvanK DpcaK DvanK T= 5 hs. Dqui, DpcaBCK1

Biotransformaciones

El mercado de los aromas está creciendo rápidamente, y se comercializan varios cientos de toneladas al año, estimándose un negocio de unas 9,7 billones de $ en 1994 Comenzando del producto de degradación de lignina, se puede obtener vainillina con un rendimiento del 10% y con un precio de mercado por debajo de 15$/kg. La vainillina natural de las judías de vainilla puede alcanzar un precio 300 veces más alto que el de la vainillina sintética. El 80% de los aromas y fragancias que se comercializan, se producen químicamente y sin embargo, el 70% de los consumidos en Alemania son “naturales” En general los rendimientos obtenidos en biotransformaciones de 1gr/l, que no son económicamente interesantes

Delftia acidovorans 250 6 5 200 4 D.O (KU) 150 Concentración (mM) 3 100 2 50 1 1 10 20 30 Tiempo (h) Vainillina Ferúlico Vainíllico D.O.

vdh fca Acido ferúlico Vainillina Ácido vainíllico COOH HC CHO COOH CH OCH3 OCH3 OCH3 OH OH OH Acido ferúlico Vainillina Ácido vainíllico

Identificación de cepas con mayor capacidad de biotransformación Pseudomonas putida 1,2 1 0,8 Metabolitos gr/l 0,6 0,4 0,2 1 2 3 4 5 6 7 Ferúlico Tiempo (h) Vainíllico Vainillina Streptomyces setonii 1,2 1 0,8 0,6 Metabolitos gr/l 0,4 0,2 4 8 12 Tiempo (h)

Mejora de condiciones de cultivo 1 Ferúlico Metabolitos (gr/l) 0.5 Vainillina Vainíllico 30 60 Tiempo (h)

70 60 50 40 30 20 10 2 4 6 8 10 Variaciones en fuentes de carbono P. fluorescens BF13 60 50 Rendimiento (%) 40 30 20 10 2 4 6 8 10 Tiempo (h) 1mg/ml 2mg/ml 4mg/ml 6mg/ml 8mg/ml

P. fluorescens BF13 1 0,8 0,6 mg/ml vanillic 0,4 0,2 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 Tiempo (h) p-cumárico m-cumárico succinico ferúlico glucosa glutámico

Utilización de mutantes en la biotransformación P. fluorescens BF13 Glucosa + 0.1%ferúlico 0,35 0,3 0,25 vanB vanA Vanillato (mg/ml) 0,2 0,15 0,1 0,05 COOH COOH 1 2 3 4 5 Tiempo (hs) OH Sin extracto de levadura OCH3 OH OH Con extracto de levadura Ácido vainíllico Protocatecuato En ferúlico son dos veces más activas El silvestre como mucho acumula 0,2mg/ml

Utilización de mutantes en la biotransformación ech vdh fcs EnoilCoA hidratasa Vainillina:NAD+ oxido-reductasa Feruloil-CoA sintetasa COOH HC CH CHO COOH fcs/ech vdh OCH3 OCH3 OCH3 OH OH OH Acido ferúlico Vainillina Ácido vainíllico Pseudomonas sp. HR199

5h 15h 18h 5h 15h 18h Metabolitos (mM) Ferulato Coniferil aldehído alcohol Vanillato Vainillina 1,2 1,0 0,8 0,6 0,4 0,2 5h 15h 18h Metabolitos (mM) 5h 15h 18h 3,0 0,5gr/l 2,0 1,0