Inmaculada Martín Burriel minma@unizar.es Aplicaciones de la PCR y otras técnicas de genética molecular en ganadería: enfermedades hereditarias y no hereditarias Inmaculada Martín Burriel minma@unizar.es

Enfermedad genética Desviación del estado de salud debida total o parcialmente a la constitución genética del individuo, en el que factores ambientales pueden cumplir una función importante en la expresión y gravedad de los defectos o síntomas

¿Cómo reconocerlas? Historia familiar – análisis de pedigríes: Reconocimiento del modo de herencia Control de filiación Especies: Perros, Caballos, Vacuno lechero

¿Cómo reconocerlas? Epidemiología de la enfermedad Aparición de casos puntuales Aparición en estirpes Análisis de pedigríes Determinación del tipo de herencia

¿Cómo reconocerlas? Examen físico: Buscar cambios estructurales, fenotipos característicos, alteraciones en las manos, pies, piel, pelo, etc.

¿Cómo reconocerlas? Examen laboratorial: Estudios bioquímicos, inmunológicos, citogenéticos y de genética molecular.

Tipos de Herencia en Medicina Veterinaria Fenotipo (enfermedad) = genotipo + ambiente Factor genético Enfermedades (o rasgos) monogénicas: Con herencia mendeliana más o menos regular Citrulinemia, BLAD, DUMPS,etc. Enfermedades de herencia multifactorial Poligénicas Monogénicas con importante componente ambiental Enfermedades de origen cromosómico (cromosomopatías) Se detectan al microscopio Se originan en la meiosis No heredables o herencia irregular Afectan a muchos genes  cuadro grave, muchos letales

Caracteres Mendelianos Perro Vaca Gato Cerdo Caballo Oveja Pollo Cabra Conejo Fenotipos totales 489 376 280 215 193 186 179 70 49 Monogénicos 131 75 47 35 29 68 72 10 13 Caracterizados a nivel molecular 43 24 15 17 22 7 3 Modelos humana 224 126 136 97 38 25 Modelo en animales 229 149 135 59 39 Online Mendelian Inheritance in Animals: http://omia.angis.org.au/ 20/01/09

Enfermedades en bovino CVM (malformación vertebral compleja) BLAD DUMPS HIPERTROFIA MUSCULAR “hm” MULEFOOT O SINDACTILISMO CITRULINEMIA http://www.gov.on.ca/OMAFRA/english/livestock/beef/facts/93-007.htm

Difusión rápida de enfermedades hereditarias (con frecuencia baja) VI JORNADAS PRODUCCION ANIMAL Difusión rápida de enfermedades hereditarias (con frecuencia baja) 17% Mejores toros de EEUU y Canada son portadores de BLAD HOLSTEINIZACION ESPAÑA MOET IA Shuster y cols. (1992)

BLAD Un gen autosómico letal recesico Ganado vacuno Holstein VI JORNADAS PRODUCCION ANIMAL BLAD Un gen autosómico letal recesico Ganado vacuno Holstein BASE MOLECULAR: Deficiencia de la proteína Mac-1 (Complejo CD 11B/CD18) Leucocitos no pueden trasportarse desde la sangre a lugares de infección BTA 1 (U 10) CONTROL: AFECTA: LOCALIZACION:

BLAD SINTOMAS Muerte de las 7 semanas a los 8 meses LESIONES VI JORNADAS PRODUCCION ANIMAL BLAD SINTOMAS Muerte de las 7 semanas a los 8 meses Fiebre Diarreas Ulceraciones Gingivitis Anorexia Retraso creto. Infecciones Pneumonia Ganglios grandes LESIONES *Necrosis ganglionar *Riñones atroficos *Serositis en rumen *Enteritis ulcerativa *Ausencia de neutrofilos en tejidos blandos *Hiperplasia de foliculos linfoides *Edema en áreas paracorticales *Congestión esplénica *Vasos dilatados

Sustitución en la posición 128 de A por G (Glicina por Ac. Aspártico) VI JORNADAS PRODUCCION ANIMAL BASE MOLECULAR Dos mutaciones Silente Sustitución en la posición 128 de A por G (Glicina por Ac. Aspártico) D128G ALTERACION DE LA PROTEINA Mac1 (CD 11/CD 18) Secuencia anómala del gen CD18: Defecto de expresión del CD18 Falta subunidad a en la integrina b 2 Alelo raro "D128G"

FRAGMENTO AMPLIFICADO: 58 b. p. del gen CD11/CD18 VI JORNADAS PRODUCCION ANIMAL FRAGMENTO AMPLIFICADO: 58 b. p. del gen CD11/CD18 OLIGONUCLEOTIDOS: CONDICIONES DE AMPLIFICACION: 94º C., 10' Desnaturalización 94º C.. 15" Hibridación Elongación 69º C., 20" 35 x VISUALIZACION DEL FRAGMENTO: Gel de agarosa al 4 % y tinción con Br Et. (luz U. V.) Desnaturalización previa DIGESTION CON ENZIMAS DE RESTRICCION: Taq I 65º C. Hae III 37º C. > 4 horas VISUALIZACION DEL PRODUCTO DIGERIDO: Gel de agarosa al 5 % y tinción con Br Et. (luz U. V.) 5' TCCGGAGGGCCAAGGGCTA 3' GAGTAGGAGAGGTCCATCAGGTAGTACAGG

AMPLIACION POR PCR: 58 bp del gen CD18 3 GENOTIPOS VI JORNADAS PRODUCCION ANIMAL AMPLIACION POR PCR: 58 bp del gen CD18 D128/D128 : Heterocigotos Sanos, portadores Homocigotos recesivos Enfermos Homocigotos dominantes Sanos, no portadores 3 GENOTIPOS D128/D128G : D128G/D128G :

G G C C T C G A C C G C C Alelo NORMAL(D 128) Alelo MUTADO (D 128 G) VI JORNADAS PRODUCCION ANIMAL G G C C T C G A C C G C C 7 bases 13 bases 30 bases 28 bases 8 9 10 11 25 26 28 27 29 30 Hae III Taq I 19 bases 9 bases 49 bases 25 bases 33 bases 58 bases ( no encuentra secuencia de corte) Alelo MUTADO (D 128 G) Secuencia reconocida por Lugar de corte de Fragmento originado por digestión con Leyenda * La mutación se produce en la base 28 Alelo NORMAL(D 128)

DIAGNOSTICO DE BLAD Diagnóstico: PCR + Taq I D/G D/G D/G G/G D/G D/D

DIAGNOSTICO COLECTIVO VI JORNADAS PRODUCCION ANIMAL DIAGNOSTICO COLECTIVO " A partir de la muestra recogida de un tanque leche de una explotación, conocer de forma rápida y económica la existencia de hembras portadoras " Método PCR detecta: " Presencia de un portador en una muestra de un tanque de leche correspondiente al ordeño de 40 hembras "

DETECCIÓN DEL SINDROME DE ESTRÉS PORCINO (PSS) $

DETECCIÓN DEL SINDROME DE ESTRÉS PORCINO (PSS) MUTACIÓN EN EL GEN DE RYR-l Receptor de la ryanodina Cambio de C (alelo Normal) por T (alelo mutado) Herencia Autosomica recesiva

DETECCIÓN DEL SINDROME DE ESTRÉS PORCINO (PSS) DETECCIÓN POR LIGAMIENTO - Halotano - Polimorfísmos bioquímicos (Hb,PGD y GPI)

DETECCIÓN DEL SINDROME DE ESTRÉS PORCINO (PSS) 199bp PCR T 165bp 34bp BsiHKA I

Factores genéticos de las EETs Introducción Implicaciones genéticas de las EETs Gen PRNP Genética de las EETs en humanos Genética de las EETs en ratón Genética de las EETs en especies de abasto: EETs en ovino (Scrapie) EETs en caprino y bovino

ENFERMEDADES NEURODEGENERATIVAS INTRODUCCIÓN ENCEFALOPATÍAS ESPONGIFORMES TRANSMISIBLES Humanas Animales Kuru Enfermedad de Creutzfeld-Jakob Insomnio Familiar Fatal Encefalopatía Espongiforme Bovina Enfermedad Transmisible del Visón SCRAPIE (Tembladera) ovino y caprino ENFERMEDADES NEURODEGENERATIVAS hereditaria esporádica - infecciosa Susceptibilidad genética

Encefalopatías Espongiformes Transmisibles INTRODUCCIÓN Encefalopatías Espongiformes Transmisibles CARACTERÍSTICAS HISTOPATOLÓGICAS COMUNES Pérdida neuronal y gliosis Depósitos de PrPSc Espongiosis Vacuolización

Agente causal de tipo infeccioso INTRODUCCIÓN Encefalopatías Espongiformes Transmisibles Agente causal de tipo infeccioso PrP (Proteína Prión) PrPC PrPSc Cambio de conformación Proteína sensible a proteasas Proteína resistente a proteasas depósito en tejidos celulares Sistema linfoide SNC

GEN PRNP (Proteína prión) INTRODUCCIÓN GEN PRNP (Proteína prión) Secuencia muy conservada en un gran número de especies (230-256 aa) Alto grado de polimorfismo SUSCEPTIBILIDAD Período de incubación relacionado con (humano, ovino y caprino)

Factores genéticos de las EETs Introducción Implicaciones genéticas de las EETs Gen PRNP Genética de las EETs en humanos Genética de las EETs en ratón Genética de las EETs en especies de abasto: EETs en ovino (Scrapie) EETs en caprino y bovino

Implicaciones genéticas de las EETs NPU (1961): Selección intra-raza según la resistencia a la infección de scrapie experimental Interacción entre el genotipo del hospedador y las cepas de scrapie.

Implicaciones genéticas de las EETs NPU: Gen Sip (Scrapie incubation period): Gen mayor que controla la duración del periodo de incubación de scrapie. sA (p.i. corto) > pA (p.i. largo) Dickinson (1968): Gen “sinc” (Scrapie incubation): Estudios experimentales en ratones. Comportamiento dependiente de la cepa de scrapie (ME7 y 22A) s7 (p.i. corto) > p7 (p.i. largo)

Implicaciones genéticas de las EETs Gen de la proteína prión (PRNP): La proteína priónica PrP aparece en la fracción infecciosa de los homogeneizados de scrapie. Asociación genética entre el gen PRNP y la longitud del periodo de incubación de scrapie en ratón. Identificación de mutaciones del gen PRNP en ciertas patologías humanas En ovino el gen mayor Sip está estrechamente ligado a PRNP . Ratones knock-out para el gen PRNP son resistentes a la enfermedad

Factores genéticos de las EETs Implicaciones genéticas de las EETs Gen PRNP Genética de las EETs en humanos Genética de las EETs en ratón Genética de las EETs en especies de abasto: EETs en ovino (Scrapie) EETs en caprino y bovino

Gen PRNP Longitud 16-22 kpb: 2 o 3 exones según la especie Región codificante (ORF) en un único exón (2kpb) Codifica una glicoproteína de membrana de entre 230 y 250 aa según la especie Altamente conservado entre especies.

Gen PRNP Proteína PrP murina Proteína PrP humana Exon1 Exon2 Exon3 ORF 3’UTR Proteína PrP murina CHO CHO 180 196 1 23 51 90 178 213 231 254 Péptido señal Repet. octapéptidos S S Unión GPI Proteína PrP humana 1 245 Http://www.errnm.cbcu.carn.ac.uk

Gen PRNP

Gen PRNP Identificación y localización del gen PRNP

Gen PRNP Homología de secuencia Humano vs Bovino Humano vs Ovino Bovino vs Ovino 66.7 % 65.4 % 94.0 % Prusiner (1998)

Gen PRNP Polimorfismos Mutaciones puntuales: Inserciones y delecciones de octapéptidos GTC GCC Val Ala PHGGGWGQ

Gen PRNP Polimorfismos Prusiner (1998)

Factores genéticos de las EETs Implicaciones genéticas de las EETs Gen PRNP Genética de las EETs en humanos Genética de las EETs en ratón Genética de las EETs en especies de abasto: EETs en ovino (Scrapie) EETs en caprino y bovino

Genética de las EETs humanas Enfermedad de Creutzfeldt-Jakob Polimorfismo más importante: Codón 129 http://www.bse.org.uk/report/volume2 Met/Met Val/Val Susceptibilidad

Genética de las EETs humanas Enfermedad de Creutzfeldt-Jakob Familiar • Mutación más común en el codón 200 - Sustitución de Lisina por Glutamina - 70% de familias Patologías distintas dependiendo de la combinación de mutaciones existente

Genética de las EETs humanas http://www.bse.org.uk/report/volume2

Genética de las EETs humanas http://www.bse.org.uk/report/volume2

Genética de las EETs humanas http://www.bse.org.uk/report/volume2

Genética de las EETs humanas Enfermedad de Creutzfeldt-Jakob Esporádica • Hipótesis muy probable: Se produce una mutación somática del gen PRNP en un número muy reducido de células.

Factores genéticos de las EETs Introducción Implicaciones genéticas de las EETs Gen PRNP Genética de las EETs en humanos Genética de las EETs en ratón Genética de las EETs en especies de abasto: EETs en ovino (Scrapie) EETs en caprino y bovino

Genética de las EETs en ratón Polimorfismos genéticos del gen Prnp murino Polimorfismos en los codones 108 y 189 determinan diferencias en el periodo de incubación de scrapie. Utilizado como modelo para confirmar la importancia de las mutaciones detectadas en el gen PRNP humano. Identificación de QTLs ligados al periodo de incubación del la enfermedad.

Genética de las EETs en ratón Búsqueda de QTLs asociados a las EETs QTL: Quantitative Trait Loci Caracteres cuantitativos determinados por el efecto aditivo de la acción de varios genes. El periodo de incubación es un carácter cuantitativo El ratón como animal modelo: Razones económicas Control del manejo Disponibilidad de líneas consanguíneas con periodos de incubación muy distintos. Loyd et al. (2001)

Genética de las EETs en ratón Búsqueda de QTLs asociados a las EETs CAST/Ei NZW/OlaHsd NZW/OlaHsd CAST/Ei F1 F2 Loyd et al. (2001)

Genética de las EETs en ratón Análisis de la F2: Inoculación intracerebral con scrapie Determinación del periodo de incubación (1000 anim) Análisis de 150 microsatélites (marcadores altamente polimórficos dispersos por todo el genoma) Análisis de ligamiento entre el genotipo de los marcadores y el periodo de incubación. Chr. 2 Chr. 11 Chr. 12 Otros QTLs: Chr. 9 y 11 (Stephenson et al., 2001) Existen otros genes relacionados con el periodo de incubación de la enfermedad Loyd et al. (2001)

Factores genéticos de las EETs Introducción Implicaciones genéticas de las EETs Gen PRNP Genética de las EETs en humanos Genética de las EETs en ratón Genética de las EETs en especies de abasto: EETs en ovino (Scrapie) EETs en caprino y bovino

Genética de las EETs en ovino Gen PrP ovino Tamaño del gen 20kpb Proteína de 256 aa Homología con bovino (94%) Secuencia aminoacídica de la PrP bovina  de la ovina en 7 u 8 posiciones Localización: 13 (13q17/18)

Más de 45 cambios aminoacídicos (Vaccari y cols., 2007) INTRODUCCIÓN GEN PRNP OVINO Más de 45 cambios aminoacídicos (Vaccari y cols., 2007) 4 codones asociados a susceptibilidad Codón 141 SCRAPIE ATÍPICO (Nor98) Codones 136 154 171 SCRAPIE CLÁSICO En scrapie y EEB experimentales y ensayos in vitro: M137T, I142K, H143R, R151C, P168L, N176K (Goldmann y cols., 2006; Vaccari y cols., 2007; Bossers y cols., 2000) Efecto protector

Genética de las EETs en ovino Estudios de los diferentes codones según la raza Codón 136 VV136 Susceptibilidad AV136 Susceptibilidad AA136 Susceptibilidad AA depende de la raza: Cheviot Ile de France Flemish Swifter Swaledale Texel Lacaune Romanov Resistencia Susceptibilidad

Genética de las EETs en ovino Estudios de los diferentes codones según la raza Codón 154 Codón 171 RR154 No determinado RH154 Cierta resistencia HH154 Resistencia QQ171 Resistencia QR171 Resistencia RR171 Resistencia 1 Suffolk en Japón

Genética de las EETs en ovino Definidos los codones se establecen las posibles variantes A R R A H Q A R H A R Q V R Q Cierta resistencia Cierta susceptibilidad Susceptibilidad

Genética de las EETs en ovino Según el genotipo del animal y su comportamiento frente a la enfermedad se definen 5 categorías de riesgo: R1: Riesgo muy bajo individual y de la progenie R2: Riesgo bajo individual y de la progenie R3: Riesgo bajo individual y progenie dependiente del otro parental R4: Scrapie ocasional y progenie con mayor riesgo que R5: El mayor riesgo a scrapie

Genética de las EETs en ovino Razas: Charolaise y Blue de Maine Riesgo 4 ARQ/ARQ ARR/VRQ Riesgo 5 ARQ/VRQ VRQ/VRQ Riesgo 3 ARR/ARQ Riesgo 1 ARR/ARR Categoría de riesgo Genotipo

Genética de las EETs en ovino Razas: Bluefaced y Leicester Riesgo 2 ARR/AHQ AHQ/AHQ Riesgo 4 ARR/ARQ ARQ/ARQ Riesgo 5 Riesgo 1 ARR/ARR Categoría de riesgo Genotipo

Genética de las EETs en ovino ¿Qué sucede en nuestras razas? Comunidad Autónoma de Aragón ¿Qué sucede en los animales con scrapie pertenecientes a nuestras razas? ¿Qué sucede en otras razas Mediterráneas?

Polimorfismo de PRNP en ovino aragonés * Determinación del riesgo genético de las razas ovinas aragonesas: Rasa Aragonesa. Ojinegra. Cartera. Maellana. Ansotana. * Búsqueda de nuevos polimorfismos en el gen PRNP. Acín, Martín-Burriel et al. (2004) J Gen Virol

Material y Métodos - Razas estudiadas : Rasa Aragonesa. (4 Rebaños) Ojinegra. (4 Rebaños) Cartera. (2 Rebaños) Maellana. (2 Rebaños) Ansotana. (1 Rebaño) - De cada rebaño: Todos los machos reproductores y hasta 50 de hembras. - Extracción y purificación del DNA de sangre entera, usando el Kit de Amersham® GFX Genomic DNA blood Minikit. Acín, Martín-Burriel et al. (2004) J Gen Virol

Componentes de la reacción Material y Métodos - Condiciones de la PCR: Componentes de la reacción Volumen / Reacción (ml) Concentración final Tp10X 2,5 1X dNTPs 2,4 120mM Cl2Mg 0,75 1,5mM Cebador-Fr 0,25 0,2mM Cebador-R H2O hasta 25 --- 94ºC 5min 72ºC 5min 94ºC 30sec TaºC 30sec 72ºC 1min (x40) Acín, Martín-Burriel et al. (2004) J Gen Virol

Material y Métodos - PCR/RFLPs: - SECUENCIACIÓN: * Codones 136 y 154 con BspHI. (O’Doherty et al., 2000) * Codón 171 con BslI y AccI. (Yuzbasiyan-Gurkan et al., 1999) - SECUENCIACIÓN: * Amplificación de toda la región codificante. - F: 5’-ATGGTGAAAAGCCACATAGGCAGT-3’ - R: 5’-CTATCCTACTATGAGAAAAATGAG-3’ * Purificación del producto PCR (NúcleoTraPCR, Marcherey-Nagel®) y secuenciación. Acín, Martín-Burriel et al. (2004) J Gen Virol

Resultados - PCR/RFLPs: 136 y 154 171 AR AH VR PCR R Q/H PCR R/Q H PCR 127 179+189 136 y 154 241 368 AR AH VR PCR 60 81 91 171 171 R Q/H PCR 125 149 171 R/Q H PCR PCR ARR/ARR ARR/AHQ AHQ/AHQ ARR/ARQ ARQ/AHQ ARR/ARH AHQ/ARH ARQ/ARQ ARQ/ARH ARQ/VRQ Acín, Martín-Burriel et al. (2004) J Gen Virol

Resultados Porcentaje de animales según su nivel de riesgo Ansotana Susceptibilidad – + R1 Ansotana Cartera Maellana R2 6% 4% R3 15% 14% 26% 26% R4 31% 39% R5 44% 47% 48% R. Aragonesa: 46 ARQ/ARQ 2 ARR/ARQ Ojinegra Rasa Aragonesa 2% 2% 2.5% 2.5% 12% 24% Scrapie Acín et al. (2004) Vet Rec 72% 83% Acín, Martín-Burriel et al. (2004) J Gen Virol

Resultados - SECUENCIACIÓN: * Se ha confirmado la mayoría de los resultados de RFLPs. Codon 171 * Se detectó (Ojinegra) la variante rara (Lisina) en el codon 171. * Se detectaron polimorfismos en 14 codones. * Se detectaron nuevos polimorfismos en la especie ovina: 101 (Q R) 151 (R G) 151 (R H) 172 (Y D) 175 (Q E) Acín, Martín-Burriel et al. (2004) J Gen Virol

Conclusiones * Las razas ovinas autóctonas analizadas se presentan como razas muy susceptibles al padecimiento de scrapie. * El gen PRNP presenta una gran variabilidad en el ovino autóctono. * La técnica de PCR/RFLPs presenta un riesgo de error en la lectura debido a la presencia de alelos raros. * La técnica de secuenciación evita los riesgos de falsas lecturas, permitiendo además detectar nuevos polimorfismos. Acín, Martín-Burriel et al. (2004) J Gen Virol

POLIMORFISMOS DEL GEN PRNP EN OVINO MARROQUÍ Serrano et al. (2007) Vet Rec

Genomic Blood DNA Purification Kit (GE Healthcare) Polimorfismos de PRNP en ovino marroquí MATERIAL Y MÉTODOS Animales OVINO MARROQUÍ: 154 animales 89 D’man 43 Boujâad 22 Sardi Extracción de DNA de sangre entera Genomic Blood DNA Purification Kit (GE Healthcare) Amplificación por PCR Fragmento de 768 pb: región codificante de PRNP Serrano et al. (2007) Vet Rec

Purificación del producto de PCR Polimorfismos de PRNP en ovino marroquí MATERIAL Y MÉTODOS PROTOCOLO de PCR Componentes Concentración final Volumen (µl) Tampón 10X 1X 5 dNTPs (1,25mM) 120µM 4,8 Cl2Mg (50mM) 1,5 Cebador-F (20mM) 5’-GGCAGTTGGATCCTGGTTCTC-3’ 0,2 0,5 Cebador-R (20mM) 5’-ACAGGAAGGTTGCCCCTATCC-3’ DNA 100-500ng 2 Taq polimerasa (5U/ml) 0,05U/µl H2O milliQ hasta -- 50 Programa 94ºC 2min 94ºC 15seg 60ºC 15seg 72ºC 20seg 72ºC 5min x 30 ciclos Purificación del producto de PCR ExoSAP-IT (USB) SECUENCIACIÓN Serrano et al. (2007) Vet Rec

Precipitación con Etanol/EDTA y desnaturalización Polimorfismos de PRNP en ovino marroquí MATERIAL Y MÉTODOS Optimización de la reacción de secuenciación Componentes Volumen / Reacción (ml) Mix (Big Dye) 4 Producto PCR 1 Cebador-F / R (3,2mM) H2O milliQ TOTAL 10 Química: Kit Big Dye Terminator (ddNTPs fluorescentes) Programa 96ºC 1min 96ºC 10seg 50ºC 5seg 60ºC 4min x 25 ciclos Precipitación con Etanol/EDTA y desnaturalización ABI PRISM 3100 Análisis estadístico (GENEPOP) : cálculo de frecuencias alélicas, haplotípicas y genotípicas Serrano et al. (2007) Vet Rec

RESULTADOS Nuevo (His Arg) Polimorfismos de PRNP en ovino marroquí RESULTADOS Análisis de las secuencias (Chromas, BioEdit) Electroferogramas de los fragmentos DNA 10 polimorfismos conocidos (112, 136, 141, 143, 154, 171, 172, 176, 231, 237) 171 176 silentes Nuevo CGT CAT (His Arg) Raza D’man Codón 114 Codón 146 AAT AGT (Asn Ser) Raza Boujâad 114 146 Serrano et al. (2007) Vet Rec

Polimorfismos relacionados con susceptibilidad Polimorfismos de PRNP en ovino marroquí RESULTADOS Polimorfismos relacionados con susceptibilidad Frecuencias de haplotipo y genotipo / codones 136, 154, 171 (Mutaciones en codón 171) Genotípicas Haplotípicas 60 80 50 ARQ/ARQ ARQ 60 40 ARR/ARQ ARR Frecuencia (%) 30 ARR/ARR Frecuencia (%) 40 ARH 20 ARH/ARQ 20 10 Boujâad D'man Sardi Boujâad D'man Sardi (razas mediterráneas) ARQ ALTA SUSCEPTIBILIDAD ARQ/ARQ ARR CIERTA RESISTENCIA ARR/ARQ SUSCEPTIBILIDAD Serrano et al. (2007) Vet Rec

RESULTADOS Otros polimorfismos 112 114 141 143 146 172 176 Polimorfismos de PRNP en ovino marroquí RESULTADOS Otros polimorfismos Frecuencias alélicas Codón Secuencia Amino ácido Boujâad D’man Sardi 112 ATG M 100 98.3 97.7 ACG T 1.7 2.3 114 CAT H 100 97.2 100 CGT R 2.8 NUEVO 141 CTT L 80.2 100 95.5 TTT F 19.8 4.5 Nor98 143 CAT H 82.5 92.15 97.7 CGT R 17.5 7.85 2.3 146 AAT N 98.83 100 100 AGT S 1.17 NUEVO 172 TAT Y 100 82.05 100 (Acín y cols., 2004) GAT D 17.95 176 AAC N 97.65 97.75 97.7 AAA K 2.35 2.25 2.3 Total 43 89 22 Serrano et al. (2007) Vet Rec

10 haplotipos (2 nuevos) 27 genotipos diferentes Polimorfismos de PRNP en ovino marroquí RESULTADOS 10 haplotipos (2 nuevos) 27 genotipos diferentes Frecuencias haplotípicas Haplotipos Sardi D’man Boujâad ARR 31.83 25.85 30.23 ARH - 3.49 ARQ 54.55 41.57 25.58 T112ARQ 2.27 1.68 R114ARQ 2.80 AF141RQ 4.54 19.77 AR143RQ 7.87 17.44 AS146RQ 1.16 ARQD172 17.98 ARQK176 2.25 2.33 Total 22 89 43 Serrano et al. (2007) Vet Rec

RESULTADOS Y DISCUSIÓN Polimorfismos de PRNP en ovino marroquí RESULTADOS Y DISCUSIÓN Primer análisis del gen PRNP en poblaciones ovinas africanas Gran variabilidad genética Susceptibilidad a scrapie clásico y atípico, a pesar de ausencia de casos de scrapie (= Australia y Nueva Zelanda) Las mutaciones detectadas aparecen también en otras razas mediterráneas, posiblemente debido a la influencia de las migraciones desde el continente africano Serrano et al. (2007) Vet Rec

Factores genéticos de las EETs Introducción Implicaciones genéticas de las EETs Gen PRNP Genética de las EETs en humanos Genética de las EETs en ratón Genética de las EETs en especies de abasto: EETs en ovino (Scrapie) EETs en caprino y bovino

24 cambios aminoacídicos descritos en la región codificante INTRODUCCIÓN GEN PRNP CAPRINO 24 cambios aminoacídicos descritos en la región codificante (Acutis y cols., 2008) Mutación más frecuente: S240P (TCC CCC) 6 codones asociados con susceptibilidad a scrapie: I142M H154R W102G + 3 repeticiones de octapéptidos Período de incubación (Goldmann y cols., 1996; Billinis y cols., 2002; Vaccari y cols., 2006) H143R N146S y N146D Q222K Resistencia (Billinis y cols., 2002; Papasavva-Stylianou y cols., 2007; Vaccari y cols., 2006)

POLIMORFISMOS DEL GEN PRNP EN POBLACIONES CAPRINAS MARROQUÍES Serrano et al. (en prensa) An Genet

MATERIAL Y MÉTODOS Animales CAPRINO MARROQUÍ: 137 animales Polimorfismos de PRNP en caprino marroquí MATERIAL Y MÉTODOS Animales CAPRINO MARROQUÍ: 137 animales 80 D’man 57 Chaouni Identificación de polimorfismos: Secuenciación (= ESTUDIO 1) Determinación y diferenciación de haplotipos: PCR alelo-específica Secuenciación Análisis estadístico: GENEPOP ARLEQUIN (estimación de frecuencias haplotípicas) Serrano et al. (en prensa) An Genet

RESULTADOS (Gln Arg) (Arg Ser) 10 polimorfismos conocidos Polimorfismos de PRNP en caprino marroquí RESULTADOS 10 polimorfismos conocidos Análisis de electroferogramas (BioEdit) 3 NUEVAS MUTACIONES 101 CGG CAG (Gln Arg) D’man Codón 101 138 139 AGC AGG (Arg Ser) D’man Codón 139 145 Codón 145 GGC GAC (Gly Asp) Chaouni y D’man Serrano et al. (en prensa) An Genet

Frecuencias bajas (< 2 %) Polimorfismos de PRNP en caprino marroquí RESULTADOS Nuevas mutaciones Frecuencias alélicas Codón Secuencia Amino ácido Chaouni D’man 101 CAG Q 100 98.1 CGG R 1.9 139 AGG 98.8 AGC S 1.3 145 GGC G 98.2 99.4 GAC D 1.8 0.6 Total 57 80 Frecuencias bajas (< 2 %) Serrano et al. (en prensa) An Genet

FRECUENCIAS INTERMEDIAS Polimorfismos de PRNP en caprino marroquí RESULTADOS Polimorfismos conocidos Frecuencias alélicas Codón Secuencia Amino ácido Chaouni D’man 37 GGG G 93 100 GTG V 7 127 GGC 98.2 AGC S 1.8 137 ATG M 95.6 97.5 ATA I 4.4 2.5 142 99.1 99.4 0.9 0.6 154 CGT R 74.6 77.5 CAT H 25.4 22.5 222 CAG Q 98.8 AAG K 1.3 240 TCC 41.2 40 CCC P 58.8 60 Total 57 80 CIERTA RESISTENCIA FRECUENCIAS INTERMEDIAS Serrano et al. (en prensa) An Genet

• Mutaciones silentes: Polimorfismos de PRNP en caprino marroquí RESULTADOS • Mutaciones silentes: Codón 181: (1.8% en raza D’man) GAC GAT (Asp) Codón 42: Codón 138: CCA CCG (Pro) AGC AGT (Ser) (Goldmann y cols., 1996; Kurosaki y cols., 2005; Acutis y cols., 2006; Babar y cols, 2007) LIGADOS AL DIMORFISMO S240P (TCC CCC) Serrano et al. (en prensa) An Genet

PCR alelo-específica S P S G A C T C T PP240 PS240 SS240 CCA TCC CA/GG Polimorfismos de PRNP en caprino marroquí PCR alelo-específica Codón 154 42 240 139 145 154 Codón 42 101 138 Codón 138 Codón 240 S P S CCA TCC CA/GG AGC AGG/C GG/AC CG/AT CC AG CC G A C T C T GGT PP240 PS240 SS240 Codón 101 Codón 139 Heterocigotos (PrP) Rev Codón 145 Secuenciación (cebador específico- S240) 139 138 Serrano et al. (en prensa) An Genet

12 haplotipos (3 nuevos) 28 genotipos diferentes Polimorfismos de PRNP en caprino marroquí RESULTADOS S240 P240 Determinación de haplotipos PCR alelo-específica Haplo 37 101 127 137 139 142 145 154 222 240 Chaouni D’man 1 G Q M R I S 15.8 26.2 2 P 41.1 43.7 3 V 7 4 1.9 5 1.8 6 4.4 2.5 1.3 8 0.9 0.6 9 D 10 H 14.9 11 10.5 11.9 12 K 12 haplotipos (3 nuevos) 28 genotipos diferentes 10 Chaouni 13 D’man Frecuencias haplotípicas 17 Estimados (4 no reales) (ARLEQUIN) Serrano et al. (en prensa) An Genet

RESULTADOS Y DISCUSIÓN Polimorfismos de PRNP en caprino marroquí RESULTADOS Y DISCUSIÓN Primer análisis de PRNP en poblaciones caprinas africanas Gran variabilidad genética Cierta resistencia a scrapie (H154) Proximidad genética con razas caprinas mediterráneas de Italia y Grecia Serrano et al. (en prensa) An Genet

Genética de las EETs en bovino Gen PrP bovino Secuencia aminoacídica de la PrP bovina  de la ovina en 7 u 8 posiciones. Polimorfismos: 22 mutaciones silentes 12 cambios aminoacídicos Repeticiones de octapéptidos 5 copias (5/5). 6 copias (6/6). El más común 5 y 6 copias (5/6) (Heterocigoto). Sin relación con la susceptibilidad a BSE

Genética de las EETs en bovino Posible control genético: Formas clásicas de BSE: cambios en la expresión de PrPC: 23 bp del en la región promotora elimina un sitio de unión de RP58 12 bp del en intrón 1 elimina el sitio SP1 de unión de FT. Forma atípica: USA 2006: E211K: análogo al humano E200K responsable de TSE hereditaria ¿Otros genes? Posibles QTLs en BTA5, 10 y 20 (Hernández-Sánchez et al. 2002); BTA17, X/YPS y posibles en BTA1, 6, 13 y 19 (Zhang et al., 2004).

ENFERMEDADES ENDEMICAS Riesgo calidad de vida - Salud Morbilidad y mortalidad SALUD Impacto económico y social Diagnóstico precoz PROTOZOOS del género Leishmania Enfermedad que afecta al hombre y perro ZOONOSIS ENDEMICA EN ARAGON (OMS indicadora de SIDA)

Presencia de factores ecológicos: RESERVORIOS ANIMALES COMO EL PERRO LEISHMANIOSIS Presencia de factores ecológicos: VECTORES RESERVORIOS ANIMALES COMO EL PERRO Diagnóstico problemático TECNICAS CLASICAS Observación microscópica en ganglio o médula Métodos serológicos:IFI NUEVAS TECNICAS Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR)

PCR Kinetoplastos: Pequeños círculos de DNA con genes repetidos SENSIBLE ESPECIFICA ECONOMICO EFICAZ Cebadores - Zona del genoma del parásito de varias copias SSUrRNA 18SrRNA Zonas bien conocidas en más de 100 especies: Leishmania infantum, Trypañosoma brucei, Trypanosoma cruzi, ...

Comparar-Zona candidata Secuencias hospedador: humano y perro Secuenias del vector: artrópodo Secuencias del Kinetoplasto: parásito Diagnóstico directo del agente etiológico: Diferenciar portadores, enfermos y sanos PCR

Ampliación del DNA Termociclador 9600 Perkin Elmer 35 ciclos muestra 15 m l. 94ºC --- 5' 94ºC --- 1' 35 ciclos 60ºC --- 1' 72ºC --- 1' 72ºC ---10' 4ºC --- hasta recoger muestra

- + DIAGNÓSTICO DE LEISHMANIA Amplificación del gen SSU rRNA repetido mas de 100 veces Muestra: Médula ósea, Ganglio linfático y Sangre. + -