“BIOLOGÍA MOLECULAR: Herramienta Biotecnológica” M.Sc. JOSE ROBERTO ALEGRIA COTO Jefe Depto. de Desarrollo Científico y Tecnológico Facultad de CCNN y Matemática Universidad de El Salvador

OBJETIVOS: Estimular el interés de los jóvenes hacia la Biología Molecular y sus aplicaciones en la Biotecnología. . Promover en los educandos el espíritu crítico hacia el potencial de la investigación biotecnológica para el desarrollo de la humanidad. Presentar elementos de juicio que permitan comprender la importancia de que investigue en biología molecular.

Anticuerpos Monoclonales . Marcadores Ingeniería Genética Tecnología del ADN Fármacos Anti-cáncer Diagnósticos Cultivo de Células Vegetales Transferencia de genes en animales Síntesis de Sondas de ADN Localización de desórdenes genéticos Clonación Solución de crimenes BIOTECNOLOGÍA Producción de Proteínas humanas Terapia Génica Bancos de ADN, ARN Proteínas Mapas de Genomas completos Biología Molecular Cultivos Celulares Anticuerpos Monoclonales Síntesis de Nuevas Proteínas Nuevos Antibióticos Nuevas Plantas y Animales Alimentos Recursos humanos químicos raros

BIOLOGÍA MOLECULAR

HUELLA GENÉTICA (DNA fingerprinting) En investigación criminal y medicina forense, antropología y manejo de vida silvestre. Esto también puede ser usado para detectar secuencias que pueden predisponer a un individuo a enfermedades genéticas tales como muchas formas de cáncer, una forma de HIV (el virus que causa el SIDA), Alzheimer, fibrosis cística, Corea de Huntington y otras condiciones.

HUELLA GENÉTICA (DNA fingerprinting) Prueba Forense. Usada en 1980 en GranBretaña como refuerzo de la ley. En USA hasta 1987. En Vir- ginia, Minnesota, Illinois y Florida, ha exonerado a individuos acusados de asaltos sexuales. Establecimiento de la paternidad. Los patrones de ADN son heredados, la mitad de la madre y la mitad del padre. Para establecer la paternidad, la huella digital genética de la madre, niño y padre alegado son comparadas.

BIOINFORMÁTICA Es la concertación de tecnologías de información con biotecnología y tecnologías relacionadas, que son vitales para competir. Estas nuevas tecnologías y métodos están cambiando procedimientos y prácticas comunes de investigación en farmacéutica, biotecnología y ciencias médicas.

GENÓMICA El Proyecto Genoma Humano se inició en 1990 previsto para el 2007, se terminó el 26 de Junio de 2000, con la secuenciación de todo el genoma humano de unos 30,000 genes y 3 mil millones de pares de bases (pb). Con la secuenciación completa del genoma humano, los investigadores pueden mover su enfoque del hallazgo de genes, el cual puede ser manejado a través de la base de datos, hacia el entendimiento de la función de dichos genes y luego a la PROTEÓMICA.

GENÓMICA

GENÓMICA El genoma humano es 10 veces mas pequeño que el genoma de la salamandra Bolitoglossa subpalmata y 200 veces menor que el de la Ameba Entre una persona y otra el ADN solo difiere en 0.2% 60% idéntico De 289 genes humanos implicados en enfermedades, hay 177 cercanamente similares a los genes de Drosophila. 20% idéntico 70% idéntico 98% idéntico Humanos 30,000 genes Chimpancé 30,000 genes Ratón 30,000 genes A. thaliana 25,000 genes C. elegans 19,000 genes D. melanogaster 13,000 genes

GENOMAS VEGETALES El 14 de Diciembre de 2000, se presentó la secuencia del genoma del primer vegetal Arabidopsis thaliana. El 26 de Enero de 2001, la secuencia del arroz (Orizae sativa). El funcionamiento de los genes en el arroz se aplicaría a cultivos principales, tales como trigo (Triticum spp) y maíz (Zea mays). El arroz tiene 50,000 genes, dos veces el de Arabidopsis, y 12 cromosomas comparado con cinco de Arabidopsis. El arroz es el genoma más simple y pequeño de los genomas de todos los cereales.

PROTEÓMICA PROTEÓMICA: describir y conocer la función de las proteínas (clave para entender y tratar las enfermedades) ”Al entender a las proteínas, los científicos consideran que finalmente podrán resolver los mecanismos bioquímicos básicos fundamentales de las enfermedades y la salud.” The Wall Street Journal

BASES DE LA PROTEÓMICA

INGENIERÍA GENÉTICA Inició su desarrollo en la década de los 70s. Con esta tecnología, se pueden aislar los genes, manipularlos, introducirlos a nuevos hospederos, y clonarlos para obtener una ventaja novedosa sobre el organismo natural. Estas tecnologías son intensivas en conocimiento dependen principalmente del recurso humano calificado, para utilizar adecuadamente la información disponible y requieren infraestructura instalada e inversiones de capital que están al alcance de países como el nuestro.

Recurso humano a nivel doctoral. QUE SE NECESITA EN INGENIERÍA GENÉTICA Políticas Nacionales. Identificación de usuarios y problemas a resolver con tecnologías del ADN recombinante. Infraestructura instalada, que requiere inversiones de capital al alcance de países como el nuestro. Recurso humano a nivel doctoral.

MÉTODOS PARA HACER INGENIERÍA GENÉTICA 1. Agrobacterium. Uso de la bacteria Como "Ingeniero Genético". La bacteria conteniendo el inserto, infecta las células de la planta produciendo la recombinación genética. 2. Acelerador de Partículas (Gene Gun). Un cañón artificial bombardea micropartículas con el inserto, sobre la célula. 3. Electroporación. Uso de carga eléctrica para que el ADN atraviese la membrana nuclear. 4. Polietilenglicol. Exposición de las membranas al PEG, facilita el movimiento de las moléculas de ADN. 5. Silicon Wiskers. Inyección con fibras microscópi-cas, que atraviesan las membranas con los insertos.

MODIFICACIONES GENÉTICAS EN ANIMALES Xenotransplantes en cerdos: inactivación del gen 1,3 galactosil transferasa, disminución de la expresión del gen antiVCAM, y transferencia del gen humano de anticoagulación. Producción de proteína C humana en leche de cerdos, para tratar desórdenes como hemofilia. Expresión de precursor de la hormona de crecimiento proteasa resitente en tejido de músculo de cerdo. Secresión de hormonas de crecimiento humano en tejido seminal de cerdo. Producción de lisostafina en glándulas mamarias de ratones que previene mastitis por S. aureus.

MODIFICACIONES GENÉTICAS EN ANIMALES Transgénesis del gen de la proteína verde fluorescente de la medusa del Pacífico en el “gusano rosado del algodón” Pectinophora gossypiella, para servir como marcador visible y el transposón piggyBac de la mariposa nocturna Trichoplusia ni, para combinar con la estrategia de irradiación para esterilización. Para el futuro control de insectos y reducción de pesticidas se realiza Ingeniería Genética en colonias de insectos para que sean fértiles en el laboratorio y estériles al ser liberados en el campo.

MODIFICACIONES GENÉTICAS EN VEGETALES (Primera Generación) Se limitan principalmente a la resistencia a herbicidas o a determinados patógenos y pestes. En varios países hay millones de hectáreas cultivadas con plantas modificadas genéticamente, tales como: frijol de soya (Glycine max), algodón (Gossypium hirsutum), tabaco, papa y maíz, en Estados Unidos (en 1999, 8.7 millones de hectáreas), Argentina (6.7 millones de hectáreas), Canadá (4 millones de hectáreas), China (0.3 millones de hectáreas).

ALIMENTOS DE MEJOR CALIDAD 2a. GENERACIÓN DE TRANSGÉNICOS ARROZ con beta caroteno de genes de narciso y de Erwinia uredovora. ARROZ fortificado con un gen de la ferritina del frijol de soya. TOMATE Flavr Savr (ADN antisentido en gen de la poligalacturonasa que degrada las pectinas en la maduración). TOMATE con tres veces y medio de beta caroteno.

APLICACIONES MÉDICAS 2a. GENERACIÓN DE TRANSGÉNICOS Frutas y vegetales, bananos (Musa paradisiaca) y papa, para producir vacunas comestibles orales: . Antígenos de virus de hepatitis B y tóxina del cólera, para inmunización oral. Expresión de proteína de cápside del virus Norwalk, contra la gastroenteritis viral. Expresión de las porinas (proteínas de membranas externas) de la Salmonella tiphi para inmunizar contra estas bacterias.

APLICACIONES MÉDICAS 2a. GENERACIÓN DE TRANSGÉNICOS Papa con la vacuna que previene la insulina dependencia de la diabetes mellitus 100 veces más poderosa que la actual vacuna. Papa con la sub-unidad B antigénica de la enterotoxina del Vibrio cholerae causante del cólera). Frijol de soya con anticuerpos que protegen contra el virus 2 de Herpes simplex (HSV). Tabaco con anticuerpos que previenen la caries dental producida por Streptococcus mutans.

PLANTAS MÁS PRODUCTIVAS 2a. GENERACIÓN DE TRANSGÉNICOS . Arroz con tres genes de enzimas de maíz: Fosfoenolpiruvato carboxilasa (PEPC), Piruvato ortofosfato dikinasa (PPDK), y NADP enzima malica (ME) que codifican la vía fotosintética C4 aumentaron la producción de arroz. Estudios de campo preliminares hechos en China y en Corea mostraron respectivamente incrementos de granos de 10-30% y de 30-35% de plantas transgénicas con PEPC y PPDK.

INDUSTRIA Y MEDIO AMBIENTE 2a. GENERACIÓN DE TRANSGÉNICOS Producción de polímeros de ácidos grasos (estólidos), componentes de fluidos hidráulicos, epoxy o derivados acetilénicos, componentes de pinturas y recubrimientos. Canola con detergente (de alto ácido laúrico) para uso industrial y otras variedades para producir polihidroxibutirato para plásticos biodegradables. Frijol de soya con ácido oleico incrementado para huevo de gallina. Maíz con aprotinina para la industria farmacéutica..

PLANTAS TRANSGÉNICAS CUESTIONADAS El cultivo de plantas transgénicas como alimentos es enfrentado a nivel mundial, principalmente en Europa, en donde los gobiernos haciendo eco a activistas ambientalistas, de Defensa de los Consumidores, de entidades poderosas de agricultores y otras ONGs, generaron una vasta oposición política que ha legislado en contra de la experimentación, introducción y comercialización de alimentos transgénicos, no así para la utilización de estas tecnologías en la producción de plantas que produzcan fármacos.

INFORME DE LA UE SOBRE OMG’s El Informe de BIOSEGURIDAD de la Unión Europea (UE) no encontró “ningún riesgo para la salud humana o el medio ambiente más allá de las habituales incertidumbres de la producción de plantas convencionales”. Resume 81 proyectos de investigación financiados por la UE durante los últimos 15 años a un costo de US $ 64 millones sobre cultivos de Organismos Genéticamente Modificados (OGM’s) y productos fabricados a partir de ellos. No han aparecido efectos ambientales no previstos, pero aún si los hubiera, “ellos serán rápidamente detectados por los sistemas de control existentes” (EUR 19884 - © European Communities, 2001).

CLONACIÓN Término genérico para la replicación en un laboratorio de genes, células u organismos de una entidad original, con copias genéticas exactas del gen, célula u organismo original. Esta técnica ha producido avances sensacionales en medicinas y vacunas. También hay investigación en clonación de células humanas, órganos y otros tejidos. Esto puede producir el reemplazo de piel, cartilagos y hueso para victimas de quemaduras y accidentes, o de órganos.

COMO CLONARON A DOLLY 1- Células de una oveja adulta son extraídas y se llevan a un estado de latencia. 2- El núcleo es removido del huevo infertilizado de otra oveja y el núcleo de la oveja donadora es colocado en su lugar. 3- Una pequeña corriente eléctrica sobre el huevo manipulado inicia los mecanismos de fertilización. 4- Hay división celular y comienza el crecimiento y el huevo es implantado en la madre nodriza similar a una fertilización in vitro. 5- El clon es llevado a término y nace la oveja.

MÉTODO DE CLONACIÓN Las células del embrión donador son separadas La célula donadora se adjunta al oocito MÉTODO DE CLONACIÓN es fusionada por una corriente eléctrica Embrión se desarrolla como un nuevo huevo fertilizado El huevo infertilizado es enucleado

CULTIVO DE CÉLULAS MADRES Consiste en tomar el núcleo de una célula del paciente adulto y transferirlo a un óvulo humano cuyo núcleo se ha eliminado previamente. El resultado sería un embrión humano clónico (un clon del paciente). Sin embargo, el embrión no se implantaría en una mujer (lo que daría lugar a un hijo clónico del paciente). Sólo se le dejaría desarrollarse unos días. Luego se elimina para obtener de él las células madre.

TECNOLOGÍA BIOCHIP DE ADN Las mutaciones, o alteraciones en el ADN de los genes, resultan en ciertas enfermedades, y frecuentemente es difícil de identificar y caracterizar esas mutaciones a causa de que los genes mas grandes tienen muchas regiones en donde las mutaciones pueden ocurrir y causar enfermedad (www.nhgri.nih.gov). Ejemplo, mutaciones en los genes BRCA1 y BRCA2, son factores de riesgo de 50-85% de cáncer de mama en la mujer. Hedenfalk et al, usando la tecnología de microarreglos, de 5361 genes identificaron 176 genes que se expresaban diferente en dos tipos de tumor. BRCA1 y BRCA2, expresan diferente tipo de genes, sugiriendo que una mutación heredable influencia el perfil de la expresión génica del cáncer (Genome Biology, vol 2, no. 4, 2001).

TECNOLOGÍA BIOCHIP DE ADN El microarreglo génico está basado en una base de datos de mas de 40,000 fragmentos de genes llamados Secuencias Expresadas Marcadoras (ESTs). Cientos o miles de ESTs son arregladas en una lámina de microscopio. Los ARNm de una célula particular son marcados con marcas “tags” fluorescentes que se hibridizan, a los ESTs en la lámina cuando estas secuencias son complementarias a aquellas del ARNm. Un escaner mide la fluorescencia de cada muestra sobre la lámina, para determinar la actividad de los genes representados por los ESTs que están en la célula (www.nhgri.nih.gov).

TECNOLOGÍA BIOCHIP DE ADN

HABITAR MÁS ALLÁ DE LA TIERRA. La NASA busca combinar avances en biotecnología y nanotecnología para modificar los genes de las plantas de manera bioregenerativo para que sus células produzcan micro sensores, transmisores y receptores moleculares, que supervisen funciones internas de las plantas e informen sobre su salud, para garantizar una buena cosecha de manera controlable y que produzcan flores y frutos bajo comando. Una idea paralela es diseñar plantas que produzcan sustancias químicas que las protejan del aumento de radiación en el espacio y en planetas con atmósferas poco densas tales como Marte.