Generalidades de Nutrición y Metabolismo de los Protozoarios Parásitos

Nutrición Dependencia metabólica del hospedero Capacidad biosintética limitada Conocimiento derivado de cultivos y en pocas especies Single omission tests: difícil sacar conclusiones Sustancias nutritivas universales: HC, aa, vitaminas, minerales y oligoelementos. Se suman: nucleósidos, AG, esteroles y porfirinas

Nutrición - Mecanismos Difusión simple: moléculas apolares, liposolubles, AG no disociados, drogas hidrofóbicas Transporte mediado: PM bajo, iones, H, Na, Cl, aa, azúcares. No utiliza energía, cinética de saturación y especificidad Transporte activo: sistemas de transporte contra gradiente de concentración Endocitosis: pinocitosis y fagocitosis

Glúcidos Transporte mediado en membranas celulares T. brucei: 2 sistemas, a) glucosa y manosa y b) fructosa y glucosamina T. equiperdium: 1 sitio de hexosas y 1 de glicerol E. histolytica: glucosa por 2 sitios, paso limitante Plasmodium: modulación de la membrana de la célula huésped (eritrocito) con poros.

Caso: Metabolismo de Galactosa en T. brucei. El metabolismo de la Gal es esencial para la sobrevida de T. brucei. Gal está presente en cantidades importantes en las VSG Los transportadores de hexosas de T. brucei son incapaces de transportar Gal que se obtiene por la epimerización de la UDP-glucosa a la UDP-galactosa por la UDP-glucosa 4´epimerasa (galE).

Generación de mutante condicional para galE Línea celular knock-out condicional (cKO) conteniendo una copia ectópica de galE inducible por Tetraciclina y ambas copias alélicas del gen reemplazadas con genes resistentes al antibiótico. En presencia de Tetraciclina (+Tet) las células cKO expresan suficiente galE para crecer normalmente. En (–Tet) se detiene la división en 3-4 días seguida de muerte celular.

Efecto de la deprivación de Gal en el crecimiento de T Efecto de la deprivación de Gal en el crecimiento de T. brucei y contenido de nucleótidos Growth of galE-cKO with and without Tet (B) ratio of UDP-Gal/UDP-Glc in the galE-cKO Tet (C) Sugar nucleotide levels of the galE-cKO Tet cells. Los niveles celulares de UDP-galactosa caen rápidamente luego de la deprivación de Gal llegando a niveles indetectables a las 72 hs.

Impacto de la deprivación de Gal sobre las VSG El análisis de las glicoproteínas extraídas por lectin blotting muestra que la Gal está virtualmente ausente y que se reducen las estructuras de poli-N-acetillactosamina

Mutante condicional null para galE Bajo condiciones no permisivas que induce la deprivación de Gal. Por medio de la adición de Tetraciclina al medio se produce la expresión de galE Después de 96h la división cesa y la ME revela una morfología alterada y aparición de vesículas aberrantes cerca del bolsillo flagelar. Scanning electron microscopy of galE-cKO Tet. Effects on cellular morphology after galactose starvation for 0 h (A), 48 h (B), 96 h (C and D), and 144 h (E and F) are shown. Scale bars, 2 m.

Impacto de la deprivación de Gal sobre las VSG El análisis por MALDI-TOF de una VSG (221) confirma la pérdida completa de galactosa del ancla de glicosilfosfatidylinositol

Aminoácidos Translocación – mediada en su gran mayoría Endocitosis de proteínas. T. brucei: 4 sitios operativos T. cruzi: Arg altamente específico, con 3 sistemas; Thr es contra gradiente, se intercambia con Ala Plasmodium: Hb es la mayor fuente de aa, ingresa por endocitosis a través del citostoma

Caso: la Arginina es un aa esencial para Toxoplasma gondii En la mayoría de los eucariotes existen dos genes de carbamoil fosfatasa sintetasa (CPS), una es glutamina dependiente y se requiere para sintetizar pirimidinas (CPSII), la otra (CPSI) está dedicada a la biosíntesis de Arg a partir de carbamoil fosfato T. gondii carece del gen de la CPSI Deprivación de Arg bloquea multiplicación en taquizoítos, lo rescata la citrulina.

Síntesis de la Arginina

Deprivación de Arg dispara transformación de taquizoítos en bradizoítos Verde: proteína expresada por taquizoítos Rojo: proteína expresada por bradizoítos Azul: núcleos teñidos con DAPI A: 48hs medio normal B: 48hs medio sin Arg C: 7 d sin Arg D: 14 d sin Arg E: Contraste de fase de D F: Cepa PLK 4 d sin Arg

La deprivación de Arg produce una detención del crecimiento en taquizoítos de T. gondii que es rescatada por citrulina pero no por ornitina

Caso: Degradación de la Hb en Plasmodium

Hemoglobina 95% de las proteínas totales de GR Abundante (>300 mg/ml o aprox 5 mM) 60-80% es degradada durante el estadio eritrocitario 110 g (en un total de 750) se consume en 48 hs con una parasitemia del 20%

Erythrocytic Shizogonic Cycle Los merozoítos interactúan con la membrana del GR e invaden activamente la célula formando una vaculoa parasitófora Merozoíto entrando un GR Trofozoíto en GR

Endocitosis del citoplasma eritrocitario cytostome food vacuole pinocytosis (rings)

Vacuola Digestiva Un lisosoma especializado ATP Digestión de Hb H+ (pH 5-5.4) ADP Proteases de la vacuola plasmepsinas I & II (acid) falcipainas I - III (tiol) falcilysinas (metallo) Camino endocítico citoplasma parasitario

El clivaje inicial de las plasmepsina es específico y desestabiliza la Hb Hb es clivada entre Phe-33 y Leu-34 (cadena α) ‘región bisagra’ conservada Importante para la estabilidad del tetrámero Se disocian grandes fragmentos de globina Se libera el grupo Hem Los fragmentos de globina son susceptibles de posterior hidrólisis a-F33/L34 í

La digestion de Hb es un proceso ordenado hemoglobina + heme fragmentos grandes de globinas Fragmentos pequeños (6-8 aa) plasmepsina falcipaina Fragmentos medianos (20 aa) falcilysina exopeptidasas aa libres?

El Heme libre es tóxico Destabiliza and lisa membranas Hidrolasas liberadas al citoplasma del parásito que muere Posibles Mecanismos de Detoxificación heme  hemozoína (pigmento malárico) Degradación mediada por H2O2 Degradación mediada por GSH heme oxygenasa (P.b. and P.k.)

Hemozoína = b-Hematina heme

b-hematina forma cristales insolubles 'biocristalización' o 'biomineralización'

Nucleótidos No pueden sintetizar nucleótidos de purinas (A G) de novo Purinas y pirimidinas deben adquirirse en forma de bases o nucleósidos. No tienen transportadores de nucleótidos En kinetoplástidos Adenosina es fuente más importante de síntesis de nucleótidos de purina Locus para transporte de nucleósidos Ribonucleasas y nucleotidasas de superficie Plasmodium: hipoxantina es fuente de purina

Vías de salvataje de purinas en parásitos

Lípidos Transportadores para AG Difusión pasiva para AG no disociados Apicomplexa: transporte a través de vacuola parasitófora Apicoplasto: plástido no fotosintético encontrado en apicomplexa adquirido por endosimbiosis secundaria Síntesis de AG e isoprenoides en apicoplasto

Metabolismo del colesterol en Toxoplasma gondii

METABOLISMO ENERGÉTICO EN PROTOZOARIOS PARÁSITOS Generalidades Objetivos del metabolismo energético a)   Catabolizar sustancias orgánicas y acoplar el proceso a la conservación de energía b)   Formar y degradar biomoléculas requeridas en funciones específicas

KINETOPLASTIDOS Trypanosoma brucei como modelo: a)     Depende únicamente de glicólisis para producir ATP. Prefiere Glu, pero también Fru, Man y Glicerol b)    Mitocondria escasamente desarrollada sin Krebs ni CR c)     Abundantes enzimas glicolíticas: 90% del glicosoma d)    Flujo glicolítico es relativamente alto e)     Enzimas glicosómicas no glicolíticas deprimidas

Glicólisis Glicosomas: Característicos de Tripanosomatidos. 0.3um, 4% del volumen celular. T. brucei=200. Glicólisis: De Glu a 3fosfoglicerato en glicosomas. Citoplasma: de 3GP a 3PEP – Piruvato. Termina en Piruvato (98%) y trazas de CO2 y Glicerol- Fermentación G3P pasa los equivalentes reductores a través de una oxidasa al O2 dentro de la mitocondria Alta eficiencia. Sobrevive aún en condiciones anaeróbicas a razón de 1ATP por 1Glucosa. Enzimas: sectores de carga + para ingresar al glicosoma. Formas procíclicas en vector: Cambio a metabolismo más mitocondrial, aumenta volumen mitocondrial, cristas desarrolladas. CR respiratoria convencional. PRO: metabolizada en CO2, ALA y ASP  

Glicólisis y glicosomas

Amebas Intestinales y Giardia Glicólisis via Embden-Meyerhof pero sin lactato deshidrogenasa. Piruvato se convierte en etanol y CO2 en anaerobiosis, en aerobiosis acetato y etanol Amitocondriados, por tanto sin Ciclo de Krebs ni fosforilación oxidativa Sin citocromos Almacenan glucógeno Toleran bajas concentraciones de oxígeno

Figure 2   Nucleoside phosphate and pyrophosphate metabolism in the glycolytic pathway of the eukaryotic anaerobic amoeba, Entamoeba histolytica. (A) The glycolytic pathway of E. histolytica. (B) PPDK uses PEP and PPi to catalyze the conversion of AMP to ATP (i.e., the production of two high-energy phosphoanhydride bonds equals two "ATP equivalents"). (C) The ATP and PPi "balance sheet" for E. histolytica glycolysis. Abbreviations are as follows: 1,3-DPGA, 1,3-diphosphoglycerate; Fru-1,6-P2, fructose-1,6-bisphosphate; Fru-6-P, fructose-6-phosphate; Glu-6-P; glucose-6-phosphate; 3-PGA, 3-phosphoglycerate; PEP, phosphoenolpyruvate; PPDK, pyruvate orthophosphate dikinase; and PPi-PFK, PPi-dependent phosphofructokinase

Enzimas glicolíticas de Entamoeba histolytica

Trichomonas Glicólisis clásica hasta piruvato que se convierte en lactato y éste en acetato, CO2 y H2O La oxidación del piruvato se cataliza por decarboxilación oxidatica en reacciones ligadas a Ferredoxina, proteina sulfurada con Fe como transportador de electrones La reacción se produce en los hidrogenosomas donde el H+ es el aceptor final de los electrones

Hidrogenosoma Generación de ATP por compartimentalización del metabolismo fermentativo del piruvato con producción de Hidrógeno molecular 1. Piruvato (de la glicólisis o por conversión del malato) es descarboxilado por la piruvato:ferredoxina oxidorreductasa para formar AcetilCoA 2. Los e- son transferidos desde la oxidorreductasa hasta la ferredoxina (Fe-S) y luego a protones para formar H2 catalizdo por la hidrogenasa. 3. Acetil-CoA es convertida a acetato con la conversión concomitante de succinato a Succinil-CoA por la succinil-CoA sintetasa. 4. La generación de succinyl-CoA está acoplada a la producción de ATP via fosforilación a nivel de substrato

Schematic Map of Hydrogenosomes CO2 hsp70 Protein import ME Pyruvate Malate cpn60 Transit peptides AAC NAD(P)H NAD(P)+ ATP N ADP NAD(P)-FO [Fe]Hyd H2 2Fd 2Fd- 2H+ ASCT Acetyl-CoA Acetate PFO Succinate Succinyl-CoA CO2 CoASH Double membrane STK Fungi and Trichomonas ATP ADP + Pi Enzyme found also in mitochondria Alpha-proteobacterial ancestry Schematic Map of Hydrogenosomes (after Muller 1993) Unknown ancestry