Generalidades de Nutrición y Metabolismo de los Protozoarios Parásitos

Nutrición Dependencia metabólica del hospedero Capacidad biosintética limitada Conocimiento derivado de cultivos y en pocas especies Single omission tests: difícil sacar conclusiones Sustancias nutritivas universales: HC, aa, vitaminas, minerales y oligoelementos. Se suman: nucleósidos, AG, esteroles y porfirinas

Nutrición - Mecanismos Difusión simple: moléculas no polares, liposolubles, AG no disociados, drogas hidrofóbicas Transporte mediado: PM bajo, iones, H, Na, Cl, aa, azúcares. No utiliza energía, cinética de saturación y especificidad Transporte activo: sistemas de transporte contra gradiente de concentración Endocitosis: pinocitosis y fagocitosis

Glúcidos Transporte mediado en membranas celulares T. brucei: 2 sistemas, a) glucosa y manosa y b) fructosa y glucosamina T. equiperdium: 1 sitio de hexosas y 1 de glicerol E. histolytica: glucosa por 2 sitios, paso limitante Plasmodium: modulación de la membrana de la célula huésped (eritrocito) con poros.

Caso: Metabolismo de Galactosa en T. brucei. El metabolismo de la Gal es esencial para la sobrevida de T. brucei. Gal está presente en cantidades importantes en las VSG Los transportadores de hexosas de T. brucei son incapaces de transportar Gal que se obtiene por la epimerización de la UDP-glucosa a la UDP-galactosa por la UDP-glucosa 4´epimerasa (galE).

Glicoconjugados de superficie en Trypanosoma brucei

Mutante condicional null para galE Bajo condiciones no permisivas que induce la deprivación de Gal. Por medio de la adición de Tetraciclina al medio se produce la expresión de galE Después de 96h la división cesa y la ME revela una morfología alterada y aparición de vesículas aberrantes cerca del bolsillo flagelar. Scanning electron microscopy of galE-cKO Tet. Effects on cellular morphology after galactose starvation for 0 h (A), 48 h (B), 96 h (C and D), and 144 h (E and F) are shown. Scale bars, 2 m.

Efecto de la deprivación de Gal en el crecimiento de T Efecto de la deprivación de Gal en el crecimiento de T. brucei y contenido de nucleótidos Growth of galE-cKO with and without Tet (B) ratio of UDP-Gal/UDP-Glc in the galE-cKO without Tet (C) Sugar nucleotide levels of the galE-cKO Tet cells. Los niveles celulares de UDP-galactosa caen rápidamente luego de la deprivación de Gal llegando a niveles indetectables a las 72 hs.

Impacto de la deprivación de Gal sobre las VSG El análisis de las glicoproteínas extraídas por lectin blotting muestra que la Gal está virtualmente ausente y que se reducen las estructuras de poli-N-acetillactosamina

Impacto de la deprivación de Gal sobre las VSG El análisis por MALDI-TOF de una VSG (221) confirma la pérdida completa de galactosa del ancla de glicosilfosfatidylinositol

Aminoácidos Translocación – mediada en su gran mayoría Endocitosis de proteínas. T. brucei: 4 sitios operativos T. cruzi: Arg altamente específico, con 3 sistemas; Thr es contra gradiente, se intercambia con Ala Plasmodium: Hb es la mayor fuente de aa, ingresa por endocitosis a través del citostoma

Caso: la Arginina es un aa esencial para Toxoplasma gondii En la mayoría de los eucariotes existen dos genes de carbamoil fosfatasa sintetasa (CPS), una es glutamina dependiente y se requiere para sintetizar pirimidinas (CPSII), la otra (CPSI) está dedicada a la biosíntesis de Arg a partir de carbamoil fosfato T. gondii carece del gen de la CPSI Deprivación de Arg bloquea multiplicación en taquizoítos, lo rescata la citrulina.

Deprivación dispara transformación de taquizoítos en bradizoítos Verde: proteína expresada por taquizoítos Rojo: proteína expresada por bradizoítos Azul: núcleos teñidos con DAPI A: 48hs medio normal B: 48hs medio sin Arg C: 7 d sin Arg D: 14 d sin Arg E: Contraste de fase de D F: Cepa PLK 4 d sin Arg

Caso: Degradación de la Hb en Plasmodium

Hemoglobina 95% de las proteínas totales de GR Abundante (>300 mg/ml o approx 5 mM) 60-80% es degradada durante el estadio eritrocitario 110 g (en un total de 750) se consumen en 48 hs con una parasitemia del 20%

Merozoíto entrando un GR Trofozoíto en GR

Endocitosis del citoplasma eritrocitario cytostome food vacuole pinocytosis (rings)

Vacuola Digestiva Un lisosoma especializado ATP digestion de hemoglobina H+ (pH 5-5.4) ADP Proteasas de la vacuola plasmepsinas I & II (aspártico) falcipainas I - III (tiol) falcilysinas (metallo) Camino endocítico citoplasma parasitario

El clivaje inicial de plasmepsinas es específico y conduce a la desestabilización de la Hb Hb es clivada entre Phe-33 y Leu-34 (cadenas α) ‘región bisagra’ conservada Importante para estabilizar el tetrámero Se forman fragmentos grandes de globina suceptibles de proteólisis posterior Se libera Heme a-F33/L34 í

La digestión de la Hb es un proceso ordenado hemoglobina + heme fragmentos de globina grandes Fragmentos chicos (6-8 aa) plasmepsina falcipaina fragmentos medios (20 aa) falcilysina Exopeptidasa? Amino acidos libres?

La vacuola Digestiva de Plasmodium Un lisosoma especializado ATP hemoglobin proteins H+ plasmepsin globin fragments ADP heme + amino acids falcipain plasmepsin falcilysin amino- peptidase ATP Pfmdr-1? small fragments (6-8 amino acids) ADP

El Heme libre es tóxico Posible Mecanismos de Detoxificación Desestabiliza y lisa membranas Las hidrolasas se liberan en el citoplasma del parásito El parásito muere Posible Mecanismos de Detoxificación heme  hemozoína (pigmento malárico) Degradación mediada por H2O2 o GSH heme oxigenasa (sólo P.b. and P.k.)

Hemozoína = b-Hematina heme

b-hematina forma cristales insolubles 'biocristalizacion' or 'biomineralización'

La vacuola digestiva Un lisosoma especializado ATP hemoglobin H+ Fe2+ plasmepsin O2 globin fragments ADP Fe3+ heme + amino acids -O2 O2 falcipain plasmepsin falcilysin ? amino- peptidase Fe se oxida después de liberarse de la Hb La oxidación promueve la formation of ROI Estrés oxidativo hemozoin ATP small fragments (6-8 amino acids) Pfmdr-1? ADP

Nucleótidos No pueden sintetizar nucleótidos de purinas (A G) de novo Purinas y pirimidinas deben adquirirse en forma de bases o nucleósidos. No tienen transportadores de nucleótidos En kinetoplástidos adenosina es fuente más importante de síntesis de nucleótidos de purina Locus para transporte de nucleósidos Ribonucleasas y nucleotidasas de superficie Plasmodium: hipoxantina es fuente de purina

Transportadores de purinas en Plasmodium

Vías de salvataje de purinas en parásitos

Lípidos Transportadores para AG Difusión pasiva para AG no disociados Apicomplexa: transporte a través de vacuola parasitófora Apicoplasto: plástido no fotosintético encontrado en apicomplexa adquirido por endosimbiosis secundaria Síntesis de AG e isoprenoides en apicoplasto

Metabolismo del colesterol en Toxoplasma gondii

METABOLISMO ENERGÉTICO EN PROTOZOARIOS PARÁSITOS Generalidades Objetivos del metabolismo energético a)   Catabolizar sustancias orgánicas y acoplar el proceso a la conservación de energía b)   Formar y degradar biomoléculas requeridas en funciones específicas

KINETOPLASTIDOS Trypanosoma brucei como modelo: a)     Depende únicamente de glicólisis para producir ATP. Prefiere Glu, pero también Fru, Man y Glicerol b)    Mitocondria escasamente desarrollada sin Krebs ni CR en formas circulantes c)     Abundantes enzimas glicolíticas: 90% del glicosoma d)    Flujo glicolítico es relativamente alto e)     Enzimas glicosómicas no glicolíticas deprimidas

Glicólisis Glicosomas: Característicos de Tripanosomatidos. 0.3um, 4% del volumen celular. T. brucei=200. Glicólisis: De Glu a 3fosfoglicerato en glicosomas. Citoplasma: de 3GP a 3PEP – Piruvato. Termina en Piruvato (98%) y trazas de CO2 y Glicerol- Fermentación G3P pasa los equivalentes reductores a través de una oxidasa al O2 dentro de la mitocondria Alta eficiencia. Sobrevive aún en condiciones anaeróbicas a razón de 1ATP por 1Glucosa. Enzimas: sectores de carga + para ingresar al glicosoma. Formas procíclicas en vector: Cambio a metabolismo más mitocondrial, aumenta volumen mitocondrial, cristas desarrolladas. CR respiratoria convencional. PRO: metabolizada en CO2, ALA y ASP  

Glicólisis y glicosomas

Amebas Intestinales y Giardia Glicólisis via Embden-Meyerhof pero sin lactato deshidrogenasa. Piruvato se convierte en etanol y CO2 en anaerobiosis, en aerobiosis acetato y etanol Amitocondriados, por tanto sin Ciclo de Krebs ni fosforilación oxidativa Sin citocromos Almacenan glucógeno Toleran bajas concentraciones de oxígeno

Glicólisis, metabolismo de las pentosas y nucleotídico en Entamoeba histolytica

Mitosomas Descrito en E. histolytica, G. lamblia El origen mitocondrial del mitosoma está apoyado por: i) Doble membrana ii) localización de proteínas de la maquinaria del cluster de Fe S (ej. Ferredoxina) iii) Transporte al mitosoma por medio de secuencias N-terminales similares a las secuencias mitocondriales iv) actividad de ensamblaje del cluster Fe S en la fracción enriquecida con mitosomas

Enzimas glicolíticas de Entamoeba histolytica

Trichomonas Glicólisis clásica hasta piruvato que se convierte en lactato y éste en acetato, CO2 y H2O La oxidación del piruvato se cataliza por decarboxilación oxidatica en reacciones ligadas a Ferredoxina, proteina sulfurada con Fe como transportador de electrones La reacción se produce en los hidrogenosomas donde el H+ es el aceptor final de los electrones

Hydrogenosomas Organelos de eucariotes anaeróbicos que generan hidrógeno molecular Comparten ancestro con mitocondrias Tricomonas

Schematic Map of Hydrogenosomes CO2 hsp70 Protein import ME Pyruvate Malate cpn60 Transit peptides AAC NAD(P)H NAD(P)+ ATP N ADP NAD(P)-FO [Fe]Hyd H2 2Fd 2Fd- 2H+ ASCT Acetyl-CoA Acetate PFO Succinate Succinyl-CoA CO2 CoASH Double membrane STK Fungi and Trichomonas ATP ADP + Pi Enzyme found also in mitochondria Alpha-proteobacterial ancestry Schematic Map of Hydrogenosomes (after Muller 1993) Unknown ancestry

Acidocalsomas Organelos ácidos Almacenan calcio En varios microorganismos Primero definidos en tripanosomátidos Alta densidad electrónica Alta concentración de fosfatos, Ca., Mg