ESCUELA POLITÉCNICA DEL EJÉRCITO INGENIERÍA EN BIOTECNOLOGÍA  DEPARTAMENTO DE CIENCIAS DE LA VIDA INGENIERÍA EN BIOTECNOLOGÍA Establecimiento de un protocolo para la propagación masiva in vitro de cabuya azul (Agave americana L.) y cabuya blanca (Furcraea andina Trel.) Previa a la obtención de Grado Académico o Título de: INGENIERO EN BIOTECNOLOGÍA ORFA HIPATIA CRIOLLO FIGUEROA Directora: M. Sc. Mónica Jadán Codirector: Ing. Marco Taipe

INTRODUCCIÓN Familia Agavaceae PRODUCCIÓN Fibras duras Economía "verde“ Familia Agavaceae Ecuador Cabuya azul (Agave americana L.) Cabuya blanca (Furcraea andina Trel.) Agavaceae Fibras Generos Economia verde. Disminución de la contaminación. PRODUCCIÓN La exportación de cabuya en el Ecuador fue de USD 144 mil y 17,39 toneladas en el 2008 (CORPEI, 2009).

PROBLEMA JUSTIFICACIÓN Falta de asesoramiento (FAO, 1994) y de desarrollo de biotecnologías. Crecimiento lento y reproducción sexual limitada (Domínguez et al., 2008). La propagación convencional no permite producción a gran escala (González et al., 2004). Propagación in vitro: Mayor número de plantas en menor tiempo . Plantaciones uniformes. Plantas libres de microorganismos. No metodología establecida para la propagación in vitro de cabuya azul y cabuya blanca.

OBJETIVOS General Específicos Establecer un protocolo para la propagación intensiva in vitro de cabuya azul (A. americana L.) y cabuya blanca (F. andina Trel.). Específicos Evaluar protocolos para la desinfección de explantes de cabuya azul y cabuya blanca. Evaluar reguladores de crecimiento a diferentes concentraciones que permita obtener la mayor tasa de multiplicación in vitro de cabuya azul y cabuya blanca. Evaluar medios para el enraizamiento de cabuya azul y cabuya blanca. Realizar un análisis económico y plan de producción in vitro de cabuya azul y cabuya blanca según los protocolos seleccionados.

Marco Teórico Cabuya azul (Agave americana) Hierba perenne de grandes rosetas acaules. Periodo de vegetación hasta la floración (8-10 años). Producen inflorescencia una sola vez. Inflorescencia 15 m Flor Reproducción Sexual: semilla. Vegetativa: rizomas. Fruto Hojas Según White es nativa del Ecuador, para Howard es originaria de México. (AA. VV., 2006; Correa y Bernal, 1989; Gupta, 1995, Paredes, 1959)

Según Jorgensen & León (1999) es nativa de la zona Andina. Marco Teórico Cabuya blanca (Furcraea andina) 10 a 15 cm Hierba perenne, xerófita y acaulescente. Inflorescencia Flor Reproducción: Sexual: semilla. Vegetativa: bulbillos 1 ,0 a 1,8 m Bulbillos Hojas Según Jorgensen & León (1999) es nativa de la zona Andina. (Correa y Bernal, 1989; León, 1987)

Marco Teórico Cultivo in vitro de tejidos vegetales Grupo de técnicas que estudia el crecimiento de células, tejidos u órganos de plantas (explante) en un medio artificial aséptico. Medio de Cultivo Macro y micro nutrientes Reguladores de crecimiento Vitaminas Fuente de carbono Suplementos no definidos Agentes gelatinizadores 95% de agua AUXINAS CITOQUININAS (George et al., 2008; Roca y Mroginski, 1991; Abdelnour y Escalant,; Trigiano & Gray, 2005)

Marco Teórico Propagación in vitro de las Agaváceas ESTABLECIMIENTO Explante: yemas adventicias y axilares, semillas, secciones de tallo, ápices de rizomas, ápices caulinares. ESTABLECIMIENTO Tomado de Martínez y Pacheco, 2006 Las citoquininas usada en especies de Agave y Furcraea es el BA y la KIN. La combinación entre BA y ANA favorece la formación de brotes. MULTIPLICACIÓN En medio basal con auxinas como: el AIA y el IBA, ó en ausencia de RC. ENRAIZAMIENTO Tomado de Domínguez et al., 2008 (Salazar et al., 2009; Ramírez, 2008; Silos et al., 2007; Martínez y Pacheco, 2006; Vargas y García, 1996; Domínguez et al., 2008)

MATERIALES Y MÉTODOS

Zona de estudio Investigación Se realizó en el laboratorio de Cultivo de Tejidos del Departamento Nacional de Biotecnología de la Estación Experimental ” Santa Catalina”, del INIAP.   Material vegetal Recolectado en los predios de la empresa UYAMA FARM, ubicados en el cantón Mira al suroeste de la provincia del Carchi.

Etapa 0: Fase preparativa Cabuya azul Material vegetal: rizomas (aprox. 1 año de edad) de 20 cm a 40 cm de alto. Cabuya blanca Material vegetal: plantas en crecimiento sanas, de aprox. 70 a 100 cm de longitud.

Etapa 1: Establecimiento in vitro Explante 1 Pre-tratamiento Tratamiento evaluados Ápice caulinar t1: Aureoles et al. (2008) Agua corriente 2gL-1 detergente NaClO al 0,077% t2: Blanco et al. (2004) t3: Martínez et al. (2006) 16 horas 1,5 a 2,0 cm 4 a 6 cm largo Sales M&S enriquecido con: 80 mgL-1 de sulfato de adenina, 0,40 mgL-1 de tiamina, 100 mgL-1 de myo-inositol, 0,7% (p/v) de agar, 3% (p/v) de azúcar y 5% (v/v) de agua de coco (AC). Medio basal modificado (MBM) descrito por Aureoles et al. (2008)

Etapa 1: Establecimiento in vitro dentro de una cámara de flujo laminar. Se realizó agitación constante en todos los pasos del protocolo. Tratamientos de desinfección T1: Protocolo modificado de Aureoles et al. (2008) T3: Protocolo de Martínez et al. (2006) Agua, jabón, Tween 20 y agua estéril. 3 min en alcohol al 70%. Hipoclorito de sodio al 10% por 5 min Solución antioxidante por 5 min. Enjuague 3 veces en agua estéril. Agua destilada estéril y Tween 20 por 10 min Alcohol al 70% por 1 min Hipoclorito de calcio al 5% por 25 min Enjuague 4 veces con agua estéril T2: Protocolo modificado de Blanco et al. (2004) Solución de ácido ascórbico (100mgL-1) por 30 min. Solución Bactericida y fungicida por 30 min. Etanol al 70% por 1 min. NaOCl al 2% + Tween 20 + ácido ascórbico (100mgL-1), por 20 min. 3 lavados con agua destilada estéril.

Etapa 1: Establecimiento in vitro Estadística aplicada Observaciones: 10 por tratamiento Variables: Explantes contaminados Explantes vivos Análisis: Discretas binarias Tablas de porcentaje Gráficos demostrativos Unidad experimental 6,7 cm Ápice caulinar 5,5 cm Se evaluó a los 15 y 30 días

Etapa 2: Multiplicación in vitro Inducción de los explantes Multiplicación in vitro Medio basal modificado (MBM) descrito por Aureoles et al. (2008) suplementado con 2 mgL-1 de benciladenina (BA) y 0,1 mgL-1 de ácido indolacético (AIA), sugerido por Benítez.. Tiempo de inducción: 30 a 32 días aproximadamente 5,6 cm Incubación: 6 semanas. 9,0 cm E. inducido 1,5 cm a 2,0 cm Unidad experimental

Etapa 2: Multiplicación in vitro Estadística aplicada DCA con 9 tratamientos Observaciones: 5 en A. americana y 6 en F. andina. Variables: Explantes regenerados Explantes con brotes Número de brotes por explante: Tamaño promedio de brotes (mm) Análisis: Discretas binarias: tablas de proporción, prueba X2 , análisis de correspondencia. Cuantitativas: ADEVA, Tukey al 5% , tablas de medias. Gráficos demostrativos Tratamientos: Trat. AUXINA mg L-1 CITOQUININA ANA BA KIN T1 0,5 1 - T2 3 T3 T4 T5 T6 T7 T8 T9 Evaluación a la sexta semana.

Etapa 3: Enraizamiento in vitro Individualización de brotes de cabuya para enraizamiento Unidad experimental 15 cm Longitud de brotes Cabuya azul : 3,1 cm a 12,7 cm Cabuya blanca: 3,1cm a 6,1cm Brote cabuya Los brotes de cabuya se incubaron por 30 días. 1,5 cm

Etapa 3: Enraizamiento in vitro Estadística aplicada DCA con 3 tratamientos . Observaciones: 10 en F. andina y diferente nro. de observaciones en A. americana. Variables: Plántulas con emisión de raíces Longitud de raíz (mm) Número de raíces Análisis Discretas binarias: tablas de proporción, prueba X2 . Cuantitativas: ADEVA, Tukey al 5% , tablas de medias. Gráficos demostrativos Tratamientos: Trat. AUXINA E1 --- E2 11,42 uM de AIA E3 2,46 uM de IBA Evaluación: 15 y 30 días

Condiciones Generales de Cultivo Medio de cultivo Incubación Temperatura: 28±2°C (Salazar et al., 2009). Fotoperiodo: 16 h de luz y 8 h de oscuridad (Aureoles et al., 2007). pH se ajustó a 5,7± 0,1 (Aureoles et al., 2007). Esterilización en autoclave a 121,5°C y 15 lb de presión por 20 min (Roca y Mroginski, 1991).

Propágulos establecidos Plantas no contaminadas Análisis económico Costeo por procesos. Costos de materiales directos, equipos , utensilios , suministros y mano de obra directa. Factores a definir para un plan de producción in vitro Protocolos más eficientes. T Propágulos establecidos Frascos Plantas no contaminadas Plantas a liberar Plantas enraizadas Plantas a multiplicar T M Nro de propágulos 1 5 7

Resultados y discusión 100 Resultados y discusión

Etapa I: Establecimiento in vitro Explantes contaminados Pruebas preliminares : 25,0 a 92,3% de contaminación Pre-tratamiento 0% 0% Microorganismos endógenos Antibióticos y fungicidas: costosos

Etapa I: Establecimiento in vitro Explantes vivos 100% de sobrevivencia en ambas cabuyas Los microorganismos compiten ventajosamente con el explante por el medio de cultivo (Roca y Mroginski, 1991; Bhojwani & Razdan, 1996). Cabuya blanca (30 d)

Etapa II: Multiplicación in vitro Cabuya azul Explantes regenerados Callosidades: T5 (1 mgL-1 KIN - 0,5 mgL-1 ANA) T7 (1 mgL-1 de KIN - 1 mgL-1 ANA) 100% de regeneración Presencia de raíz: T5 T6 T7 T8 T9 KIN (1-3 mgL-1) y ANA (0,5-1mgL-1) Sin RC A. inaequidens Koch desarrolló raíces con KIN (3 y 10mgL-1) (Aureoles et al., 2008)

Etapa II: Multiplicación in vitro Cabuya azul Explantes con brotes La presencia de los brotes si depende del factor medio de multiplicación (X2 , p<0,0001). Análisis de correspondencia múltiple T1, T2 y T4  100% de explantes con brotes Mayor proporción de BA:ANA

Etapa II: Multiplicación in vitro Cabuya azul Número de brotes ADEVA: p<0,0001 Los mejores tratamientos de proliferación son: T4, T2 y T1. Prueba tukey al 5% a a b abc bc c c c c c Explante en T4, 5ta semana BA - ANA KIN - ANA

Etapa II: Multiplicación in vitro Cabuya azul Tamaño promedio de brotes (mm) Los tamaños promedios de los brotes son estadísticamente iguales en los 6 tratamientos (p=0,3003). T1 (1 mgL-1 BA - 0,5 mgL-1 ANA) Las auxinas disminuye el efecto inhibitorio de las citoquininas en la elongación de los brotes (Trigiano & Gray, 2005)

Etapa II: Multiplicación in vitro Cabuya blanca Explantes regenerados Explantes con brotes 100% de regeneración 33,3% Chi-cuadrado: (p=0,1224). 16,7% Concentración endógenas de reguladores de crecimiento de cada planta (Salazar et al., 2009)

Etapa II: Multiplicación in vitro Cabuya blanca Número de brotes El número de brotes por explante en los 9 tratamientos de multiplicación muestran diferencia no significativa (p=0,117). - Niveles endógenos de RC. - Tiempo La baja proliferación de brotes

Chi-cuadrado: a los 15 (p=0,8747) y 30 días de incubación (p=0,7319). Etapa III: Enraizamiento in vitro Cabuya azul Presencia de raíz Porcentaje de enraizamiento a los 30 días 80,0% a 90,91% Chi-cuadrado: a los 15 (p=0,8747) y 30 días de incubación (p=0,7319). 90,91 60 ,0 E1: M&S al 100% en ausencia de RC.

Etapa III: Enraizamiento in vitro Cabuya azul Número de raíces El promedio del número de raíces es estadísticamente igual en los 3 tratamientos evaluados, a los 15 (p=0,2551) y 30 días (p=0,7189). E2 (AIA) E1 (Sin RC) Producción de auxinas endógenas

Etapa III: Enraizamiento in vitro Cabuya azul Tamaño de raíz (mm) La media del tamaño de la raíz es igual estadísticamente en los 3 tratamientos evaluados, a los quince (p=0,1607) y treinta días (p=0,6252). E3 (IBA) E1 (Sin RC)

80% de enraizamiento a los 15 días, y 100% a los 30 días de cultivo. Etapa III: Enraizamiento in vitro Cabuya blanca Presencia de raíz 80% de enraizamiento a los 15 días, y 100% a los 30 días de cultivo. 90% a 100% de enraizamiento en F. macrophylla (Martínez y Pacheco, 2006)

Etapa III: Enraizamiento in vitro Cabuya blanca Número de raíces Tamaño de raíz (mm) No hay diferencia significativa a los quince (p=0,1548) y treinta días (p=0,1351). No diferencia significativa, a los quince (p=0,2504) y treinta días (p=0,5161). E3: IBA (0,5mgL-1)

COSTO TOTAL DE PRODUCCIÓN COSTO TOTAL DE PRODUCCIÓN Análisis económico Cabuya azul Cabuya blanca COSTO DE PRODUCCIÓN (USD) Insumos directos 3550,13 Maquinaria y equipos 815,83 Materiales de laboratorio 1109,30 Suministros 1058,52 Personal 3886,20 Suman 10419,98 Valor total del costo de producción Imprevistos (5%) 521,00 COSTO TOTAL DE PRODUCCIÓN 10940,98 COSTO DE PRODUCCIÓN (USD) Insumos directos 1737,57 Maquinaria y equipos 619,30 Materiales de laboratorio 709,30 Suministros 1016,41 Personal 3886,20 Suman 7968,78 Valor total del costo de producción Imprevistos (5%) 398,44 COSTO TOTAL DE PRODUCCIÓN 8367,22 Costo unitario de la planta in vitro de cabuya azul enraizada  0,27 dólares Costo unitario de la planta in vitro de cabuya blanca enraizada  0,64 dólares

Plan de producción Cabuya azul Cabuya blanca Semanas Propágulos establecidos Nro de frascos Plantas no contaminadas (90%) Plantas a liberar Plantas enraizadas (91%) Plantas a multiplicar TM Número de propágulos 1 100 explantes 100 90   11 990 7 330 891 709 645 182 2002 13 667 1802 1620 1474 19 Cabuya blanca Semanas Propágulos establecidos Nro de frascos Plantas no contaminadas (90%) Plantas a liberar Plantas enraizadas (100%) Plantas a multiplicar TM Número de propágulos 1 100 90 7 18 81 2,5 203 13 41 182 456 19 91 410 1025 25 205 923 123 800 2000 31 400 1800 1000 37

conclusiones

El éxito en la desinfección en cabuya blanca y cabuya azul estuvo dada por la implementación del pre-tratamiento, donde se obtuvo un rango de contaminación de 0 a 20%. Los mejores tratamientos de desinfección para cabuya azul, que alcanzaron 0% de contaminación y 100% de explantes vivos, fueron los descritos por Aureoles et al. (2008) y Martínez et al. (2006).   El mejor tratamiento de desinfección para cabuya blanca, que obtuvo 0% de contaminación, 100% de explantes vivos y sin la utilización de antibióticos, fue el descrito Martínez et al. (2006).

En cabuya azul los mejores tratamientos de proliferación de brotes, con diferencia significativa (p<0,0001), fueron T1, T2 y T4. En cabuya blanca los nueve tratamientos de multiplicación analizados no resultaron favorables para la propagación de esta especie a gran escala. La inducción a la formación y crecimiento de raíces en cabuya azul estuvo favorecida en medio con sales M&S, suplementado con vitaminas y agua de coco, en ausencia de reguladores de crecimiento.

Basado en la disminución de costos y la facilidad de enraizamiento de cabuya blanca, el mejor tratamiento de enraizamiento es el medio compuesto de sales M&S, suplementado vitaminas y agua de coco. El precio de una planta de cabuya azul enraizada a escala piloto, obtenido mediante la estimación de los costos directos de producción basados en la capacidad operacional del Laboratorio de Cultivos de Tejidos (INIAP), es de 0,27 dólares. El bajo rendimiento anual teórico en cabuya blanca dado por una baja tasa de multiplicación, incrementa los costo de producción, donde el precio de una planta enraizada a escala piloto es de 0,64 dólares.

Recomendaciones

Se recomienda probar en cabuya blanca menor tiempo de exposición al pre-tratamiento, como también ensayar concentraciones menores a 0,077% de hipoclorito de sodio. En cabuya blanca se recomienda probar concentraciones mayores a 3 mgL-1 de BA en la etapa de multiplicación. Se recomienda realizar estudios para la obtención y conservación germoplasma de las cabuyas, Agave americana L. y Furcraea andina Trel.

Cabuya azul Cabuya blanca GRACIAS Empresa UYAMA FARM