Inmunoensayo con esferas paramagnéticas Bead Assay Inmunoensayo con esferas paramagnéticas

AFTOSA - FMD (foot and mouth disease) Es la enfermedad infecciosa mas importante en animales de hacienda debido a su fuerte impacto económico Es altamente contagiosa (contacto directo y aerosoles) No presenta un mortalidad muy alta, pero produce perdidas en la produccion pecuaria por un considerable periodo de tiempo

FMD virus (FMDV) Agente etiológico de la FMD Presenta una distribución mundial a excepción de América del Norte, Australia y Nueva Zelanda Pertenece a la familia Picornaviridae y al genero Aphthovirus Hay 7 serotipos (A, O, C, Asia 1 y South Africa Territories 1, 2 y 3) Genoma RNAsc + de 8500 bases aproximadamente, rodeado por 60 copias de cada una de las cuatro proteínas estructurales (VP1, 2, 3 y 4) formando una cápside icosahedrica Dentro del virion hay una pequeña cantidad de VP0 (precursor de VP2 y 4) y una copia de VPg (genome-linked protein, 3B) que se une covalentemente al extremo 5`del RNA Posee un unico marco abierto de lectura (ORF)

Organización genómica del FMDV El RNA es traducido como un único ORF en una gran poliproteína Posteriormente sufre modificaciones postraduccionales, cortes proteolíticos generándose formas intermediarias y maduras de proteínas estructurales y no estructurales (NS) Basándose en los productos de estos primeros cortes proteolíticos se divide al genoma en 4 regiones L posee los dos AUG de iniciacion P1 las cuatro proteinas estructurales VP4, VP2, VP3 y VP1 P2 tres NS (2A, 2B y 2C) P3 cuatro NS (3A, VPg, 3Cpro y 3Dpol )

Organización genómica del FMDV

Ciclo de infección del FMDV Interacción temprana: Adsorción, penetración y denudamiento Adsorción: FMDV une rápidamente a células en cultivo utilizando un numero limitado de sitios receptores (VP1-Receptor de Fibronectina, VP1-HS) Traducción viral Posteriormente al denudamiento, la proteína asociada al genoma viral (VPg) es clivada por enzimas celulares Los productos del clivado del factor de iniciación de síntesis proteica (eIF4G) por la proteasa viral Lpro inhiben la traducción Cap dependiente del mRNA en células infectadas y permiten el inicio de la traducción del RNA viral La poliproteína viral es cortada por una proteasa viral (3Cpro) relacionada con la familia de las serina proteasas, cuyos productos dan lugar a formas inmaduras y maduras de las proteínas estructurales y NS

Ciclo de infección del FMDV Trascripción viral y replicación del genoma Partiendo del RNA+ asociado a la VPg, la RNA polimerasa viral RNA dependiente 3Dpol genera un RNA- La forma replicativa (RF) es un RNAdc (RNA-/+), es necesario separar las dos hebras de RNA para el inicio y elongación de las nuevas moléculas de RNA+ (2C actividad ATPasa y motivos de Helicasa?) Encapsidamiento y maduración viral El paso final en el proceso replicativo es el encapsidamiento del RNA+ y el posterior clivado del precursor VP0 en las formas maduras VP2 y VP4

Factores de Patogénesis Por definición todas las proteínas virales estructurales y no estructurales serian en alguna medida factores de patogénesis Los más determinantes: VP1: absorción viral, interactúa con los receptores celulares Lpro: proteasa que inhibe la traducción cap dependiente en las células infectadas y permite el inicio de la traducción del RNA viral

Respuesta del huésped FMDV produce una rápida respuesta humoral tanto en animales infectados como vacunados Esta es dirigida a epitopes de las tres proteínas estructurales presentes en la superficie de la cápside viral (VP1, VP2 y VP3) Una buena respuesta protectiva aparece entre los 7 a 14 días post infección o vacunación Existe el estado de portador, desconociéndose su implicancia en el mantenimiento del virus en la población

Control de la enfermedad Vacunas corrientes Virus inactivo Para su producción se precisan altas medidas de contención (P4), aumentando su costo La presencia de NS contaminantes es casi inevitable Dificulta diferenciar animales infectados de vacunados No produce una rápida respuesta protectiva (ventana infectiva) Pool de antígenos virales

Control de la enfermedad Estrategias alternativas de vacunación Proteínas y péptidos VP1 purificado Péptidos derivados de VP1 Péptidos de VP1 químicamente sintetizados Expresión de proteínas fusionadas a VP1 Vacunas a virus atenuado Cápside viral vacía

Diagnóstico Un componente esencial en toda estrategia de control de enfermedad es un método de diagnóstico rápido que confirme los signos clínicos iniciales (vesículas, estomatitis, etc) Debe ser lo suficientemente sensible como para distinguir entre un animal infectado o uno convaleciente o vacunado

Diagnóstico ELISA de captura antigénica RT-PCR Se obtienen resultados a las 4 a 6 horas de recibida la muestra Los resultados negativos deben ser confirmados por inoculación de cultivos celulares sensibles, demorando 4 días RT-PCR En desarrollo Los resultados se obtienen aproximadamente a las 2 horas

Diagnóstico Ensayos para diferenciar animales infectados de vacunados Cowan y Graves describen un antígeno NS de FMDV altamente inmunogénico (VIAA, virus infection associated antigen), que luego se demostrará que es la RNA polimerasa viral 3Dpol Estudios de radioinmunoprecipitación identificaron un grupo de NS que reaccionaban con los sueros de animales infectados, pero no con los de animales vacunados. Estos son: 3AB 2C 3C 2B Actualmente se utiliza un método ELISA con los antígenos NS seleccionados (3AB, 2C, 3C y 2B)

Ensayo con esferas paramagnéticas La tecnología de esferas paramagnéticas se emplea para inmunoensayos, para la purificación de ácidos nucleicos, proteínas, etc. Al ser partículas magnéticas pueden ser rápidamente separadas de una suspensión sin requerir centrifugaciones, filtraciones, etc. Las esferas están cubiertas por grupos activos que en situaciones adecuadas reaccionan y unen covalentemente la proteína seleccionada Poseen una gran superficie de contacto lo que favorece al pegado de las proteínas y la sensibilidad final del ensayo

Ensayo con esferas paramagnéticas El Antígeno NS seleccionado es la Poliproteína viral 3ABC Altamente inmunogénica Presente únicamente en animales infectados Se obtiene por clonado en un vector de expresión luego se transforman células competentes y se induce en medio con IPTG Se purifica y se realiza el “pegado” a las esferas paramagnéticas

Ensayo con esferas paramagnéticas Método Los sueros a ensayar se los incuba con una suspensión de esferas paramagnéticas durante una hora a RT Se imantan las muestras, se retira el sobrenadante y se realizan varios lavados Se incuban con un segundo anticuerpo (conjugado Cy5-Goat anti Bovine IgG) Se vuelven a imantar, se retira el sobrenadante y se hacen los lavados con PBS Se leen las muestras en un Fluorómetro

Ensayo con esferas paramagnéticas Resultados Se ensayaron los siguientes sueros Suero infectado 325 Suero normal 915 Sueros Vacunados Blanco: Esferas + PBS + Conjugado

Ensayo con esferas paramagnéticas

Ensayo con esferas paramagnéticas