EQUIPO UTILIZADO EN HISTOLOGIA

Técnicas Histológicas

INTRODUCCION AL ESTUDIO DE LA HISTOLOGIA HISTOLOGIA “estudio del tejido” Es la rama de la Anatomía que estudia los tejidos de los Animales y las Plantas La mayor parte de los tejidos no puede ser observada in vivo. La visualización de organismos vivos y sus estructuras es mediante el uso del microscopio. Se requiere una serie de manipulaciones, ya que la mayoría de las estructuras son transparentes y se encuentran formando masas macizas tridimensionales donde se superponen unas a otras Las células en cultivo se pueden observar directamente. La forma más común y clara de observar estructuras es mediante el estudio de tejidos muertos y coloreados. ANATOMIA MICROSCOPICA

INMEDIATO O VITALES PROCEDIMIENTOS MEDIATO O POSVITALES

TECNICA HISTOLOGICA ES EL CONJUNTO DE PROCEDIMIENTOS REALIZADOS PARA OBTENER UN PREPARADO HISTOLOGICO La MUERTE es la interrupción irreversible de los procesos biológicos. Una vez ocurrida comienzan los procesos degradativos en tres niveles: QUÍMICO: desciende el pH y se activan los sistemas hidrolíticos que provocan alteraciones marcadas en los tejidos. CELULAR: se alteran las membranas, lo que produce que los elementos internos difundan hacia el exterior. ORGÁNICO: sobre los tejidos actúan microorganismos que producen la degradación completa de los componentes celulares.

SU FINALIDAD ES PREPARAR: CELULAR: se alteran las membranas, lo que produce que los elementos internos difundan hacia el exterior. CÉLULAS, TEJIDOS Y ORGANOS QUÍMICO: desciende el pH y se activan los sistemas hidrolíticos que provocan alteraciones marcadas en los tejidos. conociendo la anatomía, debemos dirigirnos directamente a los órganos que nos interesan estudiar. En el caso de que estos sean varios, es conveniente extraer primero los que más fácilmente se descomponen, estos son el páncreas y la porción inferior del tubo digestivo.

TECNICA HISTOLOGICA PREPARADO HISTOLOGICO: Es una rebanada de tejido colocada sobre una lámina portaobjetos, coloreada y cubierta por una lámina cubre-objetos.

TECNICA HISTOLOGICA ETAPAS DE LA TECNICA HISTOLOGICA OBTENCION DEL MATERIAL FIJACION OBTENCION DEL BLOQUE DE PARAFINA CORTE COLORACION MONTAJE Debido a ese hecho, deben ser sometidos a procesos de fijación, para que su estructura morfológica sea preservada. Las muestras pueden ser obtenidas por: Frotis Aspiración y/o lavado Punción/aspiración con aguja fina Impronta Biopsia Punción con trocar Necropsia.

TECNICA HISTOLOGICA PROBLEMAS DE INTERPRETACION al visualizar los cortes con el Microscopio A.- ARTEFACTOS: Cambios estructurales inducidos por las técnicas histológicas. B.- CONCEPTUALES

TECNICA HISTOLOGICA PROBLEMAS DE INTERPRETACION A.- ARTEFACTOS: DE FIJACION Precipitación de las proteínas. DE DESHIDRATACION Y ACLARAMIENTO Espacios opticamente vacíos DE LOS CORTES cortes de diferente grosor DEL MONTAJE pliegues DEGENERACION POSTMORTEN FINAL

GRACIAS

TECNICA HISTOLOGICA TOMA DE MUESTRAS Las muestras pueden ser obtenidas por:- Frotis. Aspiración y/o lavado punción aspiración con aguja fina impronta biopsia punción con trocar, o autopsia. HISTOLOGIA TEJIDOS NORMALES ANATOMIA PATOLOGICA TEJ. PATOLOGICOS

TECNICA HISTOLOGICA SI LA MUESTRA DE TEJIDO NO SE FIJA SE FIJA AUTOLISIS CONSERVA LAS CARACTERISTICAS

TECNICA HISTOLOGICA FIJACION: Es la fase en la cual se preserva la morfología y la composición química de los tejidos evitando la AUTOLISIS

CONDICIONES DE UN BUEN FIJADOR: TECNICA HISTOLOGICA CONDICIONES DE UN BUEN FIJADOR: Preservar el tejido No producir artificios No dificultar el tratamiento ulterior Poder y velocidad de penetración SOLUCION AL 40% DE ALDEHIDO FORMICO USO FORMOL AL 10%

Para la FIJACIÓN DE PROTEINAS es necesario evitar su hidrólisis, bloqueando los lugares susceptibles de hidrólisis mediante: - Reticularización o desnaturalización, creando redes estables empleando aldehidos como formaldehido ,ver actuación del formol , que se usa en solución acuosa al 2 % (formalina) para microscopía óptica, y glutaraldehido que se emplea al 2% en tampón, para microscopia electrónica. - Formación de sales insolubles, mediante productos como el. acido picrico empleado en la confección del fijador de Bouin. El cloruro de mercurio (muy tóxico) y el dicromáto potásico. - Cambios en el estado coloidal, mediante el calor (no recomendable). - Modificación del punto isoeléctrico, con ácido acético.

Para la FIJACIÓN DE LOS HIDRATOS DE CARBONO es necesario evitar que se disuelvan en agua, para ello hay que extraer el agua mediante fijadores cuya avided por el agua sea mayor que ellos, asi se emplea alcohol etilico (alcohol etílico al 70% en agua), y acetona. Tienen el inconveniente que retraen los tejido y los endurecen para el procesamiento posterior. Para la FIJACIÓN DE LOS LIPIDOS es necesario evitar su oxidación o enranciamiento bloqueando los lugares donde existen enlaces - CH=CH - mediante sutancias como tetróxido de osmio (acido osmico),ver actuación del osmio, es el fijador ideal para microscopía electrónica, pues se fija en los dobles enlaces de las cadenas laterales de los lípidos de las membranas plasmáticas, y además el Os es un metal opaco a los electrones (sirve de tinción).

TECNICA HISTOLOGICA PASOS OBTENCION DEL BLOQUE DE PARAFINA DESHIDRATACION ACLARAMIENTO PASOS IMPREGNACION INCLUSION EN PARAFINA

TECNICA HISTOLOGICA OBTENCION DEL BLOQUE DE PARAFINA TEJIDOS (Ricos en agua) DESHIDRATACION TEJIDOS RICOS EN ALCOHOL ACLARAMIENTO TEJIDOS RICOS EN XILOL IMPREGNACION EN PARAFINA

TECNICA HISTOLOGICA Luego de la Impregnación se Incluye en parafina, en pequeños cubos que forman el BLOQUE DE PARAFINA

TECNICA DE CORTE. - La obtención de rebanadas (cortes) de cuerpos sólidos, tiene por objeto el observar secciones translucidas de sus estructuras inernas. Los cortes demasiado gruesos permiten observar mas estructuras, pero con menos definición pues se superponen unas a otras. Los cortes finos pèrmiten ver menos estructura, pero con mas definición y finura. - Para obtener cortes del cuerpo solido, se necesita que este posea un grado de dureza minimo, y proporcional a la finura de la rebanada que deseemos obtener: mas duro = mas fino. - Como la mayoría de los tejidos corporales son blandos, es necesario endurecerlos mediante las siguientes estrategias:

1ª- Fijación en glutaraldehido: Ideal para cortes gruesos a mano alzada, mediante el microtomo de mano y navaja barbera (0,5- 3 mm de grosor), o mediante vibratomo.(0,5- 1 mm de grosor). 2ª- Congelación en microtomo: -2 a -5 ºC. Ideal para hacer preparaciones rápidas, p.e. peroperatorias en antequirógfano.(50-100 micras de grosor) 3ª- Congelación en criostato: -15 a -30 ºC. Ideal para cortes finos en histoquímica.(5-20 micras de grosor)

4ª- Inclusión en Parafina: Ideal para trabajo de cortes en serie y de alta estabilidad. Rutina de laboratorio.(5-20 micras). Los cortes se realizan en un aparato llamado microtomo de parafina (imagen derecha), La la pieza, en amarillo, se coloca en un brazo que se desliza verticalmente sobre una cuchilla, en azul, recubierta por un antirroll (antienrrollamiento) en azul mas claro. 5ª- Inclusión en celoidina: Ideal para grandes piezas: p.e. Pulmon entero. Cerebro entero, etc.(100-200 micras) 6ª- Inclusión en resinas epoxi: araldit, vestopal, etc Ideal para microscopía electerónica (20-40 nm) y corte de objetos extremadamente duros: hueso y diente. Se corta en el ultramicrotomo.mediante cuchillas de vidrio odiamante..

C.- Se monta el corte en la B.- Se coloca en el Baño de María EL CORTE C.- Se monta el corte en la lámina Portaobjetos A.- Se corta en el microtomo EJEMPLOS

TECNICA HISTOLOGICA COLORACION: ES UNA SUSTANCIA CAPAZ DE COMUNICAR SU COLORACION A OTROS CUERPOS COLORANTE La coloración más usada es HEMATOXILINA - EOSINA

TECNICA HISTOLOGICA BATERIA DE COLORACION

Colorante ACIDO, tiñe de Rosado o Rojo elementos básicos TECNICA HISTOLOGICA HEMATOXILINA Colorante BÁSICO tiñe de Azul o púrpura, elementos ácidos Ej. El Núcleo COLORACION EOSINA Colorante ACIDO, tiñe de Rosado o Rojo elementos básicos Ej. Citoplasma

TECNICA HISTOLOGICA PASOS DE LA COLORACION DESPARAFINAR REHIDRATAR HEMATOXILINA DIFERENCIAR EOSINA ALCOHOL XILOL

TECNICA DEL PAS ( Peryodic Acid Schiff) Para detectar enlaces 1-2 glicol (mucopolisacaridos) Y AZUL ALCIAN (mucopolisacaridos ácidos). -Ver actuacion del PAS.- 1º.- Desparafinar e hidratar los cortes. 2º.- Solución de azul alcian.-------------------------------10 min. 3º.- Lavar en Agua destilada . 4º.- Sol. de ácido peryódico .-----------------------------10 min 5º.- Lavado con Agua destilada. 6º.- Solución dc Schiff.------------------------------------30 min 7º.- Lavado con agua sulfurosa 1 mm., agua destilada- 1 mm. y repetir varias veces. 8º.- Lavar con agua corriente hasta que tome color rojo -- 30 min. 9º.- Teñir con Hernatoxilina (contraste de núcleos)----------2 min. 10º.- Lavar, deshidratar, aclarar y montar.

Solución de azul alcian:Azul El acido peryódico (I04H) reaciona con los enlaces 1-2 glicol (-CHOH-OHHC-) transformándolos en aldehídos (-COH HOC-) donde se fija el reactivo se Schiff F(SO3H)2 El ácido peryódico no actúa cuando los grupos glicol están bloqueados por radicales ácidos Solución de azul alcian:Azul alcian---------- 1 gr. Acido acético------- 3 c.c Agua destilada----- 97 c.c Solución de Acido IO4H -------------- 1 gr. Agua destilada.-- 100 ml. Solución de Schiff: Hervir 100 c.c. de agua destilada, apartarla del fuego y añadir 1 gr. de fucsina básica. A los 5 mm. añadir 1,5 gr. de metabisulfito sódico potásico Na2O3S2 y 3 c.c. de CIH normal, tapar el recipiente y dejar reposar durante 24 horas. en oscuridad. Depurar con carbón y filtrar. Si toma color paja, tira.r Agua sulfurosa: Metabisulfito sódico, SO3HNa, ----0,5 gr. AD------------------------------ 100 ml. CIH-----------------------------3-4 gotas

CORTES HISTOLOGICOS HEMATOXILINA-EOSINA

Hematoxilina y Eosina. 1º.- Las láminas ya hidratadas se cubren con la Solución de hematoxilina durante 5 minutos. 2º.- Se lavan varias veces con agua durante un total de 15 minutos como mínimo. 3º.- Se cubren con la Solución de eosina durante 5 mm. 4º.- Lavar rápidamente. 5º.- Deshidratar con alcoholes de concentraciones crecientes 70%, 90%, 100% (deshidratar). 6º.- Aclarar en xilol y montar cl cubre con bálsamo del Canadá (aclarar y montar). RESULTADOS La cromatina nuclear y compuestos basófilos aparecen en azul por la hematoxilina. El citoplasma, colágeno y compuestos acidófilos se tiñen en rosa o rojo por la eosina.

CORTES HISTOLOGICOS Tejido adiposo con distintas coloraciones SUDAN

SUDAN ROJO PARA TEÑIR LIPIDOS SIMPLES. 1º.- Cortes obtenidos por congelación (La inclusión en parafina disuelve las grasas). 2º.- Introducir los cortes en la mezcla a partes iguales de Sudan III (saturación en Alcohol de 70º.) y Rojo Escarlata (saturación en alcohol de 70º .) (filtrado). 24 horas. 3º.- Lavar en agua destilada. 4º.- Teñir los nucleos con Hematoxilina de Groat--2 minutos. 5º.- Lavar y secar con papel de filtro. 6º.- Montar en Plasdona. Hematoxilina de Groat Una parte de: Acido sulfurico concentrado--------0.8 ml. Alunbre Férrico-------- 1 gr. Agua destilada --------- 50 ml. Dos partes de: Hematoxilina--0.5gr. Alcoholde 95º- 50ml

COLORACIONES ESPECIALES IMPREGNACION ARGENTICA

COLORACIONES ESPECIALES AZAN MODIFICADO GIEMSA

TECNICA HISTOLOGICA MONTAJE Con un pegamento especial se coloca el Cubreobjeto sobre el tejido que se encuentra en el portaobjeto

Finalmente, cubrimos los "portas" con una delgada lámina de vidrio (cubreobjetos) en la cual colocamos una gota de medio adhesivo.

La parafina se coloca en una estufa a 70º C, con lo que se licua, introduciendo en ella la pieza que ha permanecido en benzol. Se deja toda la noche en la parafina A la mañana siguiente sacando la pieza de la estufa con parafina líquida y se confecciona el bloque, dejándole solidificar a temperatura ambiente

Una vez que el bloque se ha endurecido se adhiere sobre un taco de madera, por medio de espátula caliente

El bloque endurecido se instala en el micrótomo de parafina, procediéndose al corte (Fig. N° 5).

Los cortes obtenidos, se extienden con ayuda de un pincel sobre el agua de un baño con agua caliente, pescándolo sobre un porta que se introduce por debajo

Una vez que han sido extraídos del baño María, se proceden a montar en el portaobjetos.

Los portas con los cortes se introducen inclinados en la estufa de 70º C para que se licue la parafina sobrante y escurra. Se introducen en un recipiente con xilol para que la parafina se disuelva. El corte libre de parafina es necesario hidratarlo para que se pueda proceder a su coloración. La hidratación sigue un proceso inverso a la deshidratación. Se pasa por alcoholes de concentraciones decrecientes, terminando en agua igual que en el proceso de corte por congelación

ACTUACION

Fijador de Bouin Aciclo pícrico a saturación-----------1.000 ml.. Acetato de cobre----------------------- 25 gr. Formalina (formol comercial al 10%---- l00 c.c

ACTUACION