Ciclo de Krebs y Bioenergética BIOQUÍMICA Año 2013 GLS

Las 3 Etapas de la Respiración Oxidación metabólica de sustratos orgánicos 1. Generación de grupo acetilo del ACETIL~CoA, desde PIRUVATO, ÁCIDOS GRASOS (mitocondria), o AMINOÁCIDOS (citoplasma/mitocondria). 2. Oxidación de los carbonos del acetilo en el CICLO DE KREBS(mitocondria). 3. Pasaje de electrones de la oxidación en un segundo paso a través del sistema de TRANSPORTE DE ELECTRONES para obtener ATP en la FOSFORILACIÓN OXIDATIVA.

Oxidación Fosforilativa PROTEÍNAS POLISACÁRIDOS GLICÉRIDOS 1° Etapa AMINOÁCIDOS GLUCOSA GLICEROL + AG 2° Etapa PIRUVATO MITOCONDRIA ACETIL-CoA CO2 H+ 3° Etapa (NADH, FADH2) ADP + Pi Oxidación Fosforilativa ½O2 ATP H2O

Grupo alimenticio Unidad metabolizada Transformación convergente Carbohidratos Glucosa ENERGÍA en ATP Grasas (Lípidos) Acidos grasos Proteínas Aminoácidos

Animales, plantas y muchos microorganismos en condiciones aeróbicas Fermentación a Lactato en esfuerzos musculares, eritrocitos, otras células y algunos microorganismos Fermentación a Alcohol en levaduras - O2 + O2

CICLO DE LOS ACIDOS TRICARBOXILICOS Papel central en el metabolismo. Reacciones individuales. Estequiometría y rendimiento energético. Regulación.

Transaminaciones, Βeta-oxidación, Ciclo de Krebs, Cad. Respiratoria y Síntesis de ATP Glucólisis, Pentosas-P, Transaminaciones Sínt. Ács Nucleicos y regulación de la expresión Sínt. y secreción de Proteínas Glicosilación Acilación Nucleolo Golgi Citoplasma Núcleo Citoesqueleto Lisosoma Ribosoma (sínt. Prots.) RELiso Centríolo Vesícula Mitocondria Imagen de Magnus Manske RER Vacuola

TRENES DE H+ para NADH CITOPLASMÁTICO NADH+H+ NAD+ Di-HO-ACETONA-P---------------> GLICEROL-3P FAD+ Glicerol-3P-DH (Citosol) Di-HO-ACETONA-P Gli-3-P-DH (Mitocondrial) FADH2 NADH + H+ Malato Oxalacetato  Aspartato Ca++ [200mM] +K+ Acil-S-CoA (+) (-) ADP ATP AA, Malato, Succinato, Piruvato Translocasas NAD+, NADH, FAD HS-CoA

Piruvato Es el final de la glucolisis Es un punto de inicio para la gluconeogénesis. En la fermentación es convertido a lactato , etanol, AGV…. Algunos AA se degradan a Piruvato, y a estos les da origen: alanina, cisteina, glicina, serina, treonina, y triptofano. Las Enzs que actúan s/ el Piruvato son: Piruvato Quinasa Piruvato Descarboxilasa Piruvato Deshidrogenasa Lactato Deshidrogenasa Piruvato Carboxilasa Transaminasas Piruvato

Descarboxilación Oxidativa del Piruvato 1) Descarboxilación exergónica y fijación del resto acilo a la TPP-Enz 2) Formación de sulfoester de alta Energía con Lipoato 3) Transtiolación isoergónica del acetilo desde el Lipoato a la HS-CoA Enzima Cosustrato prostético Sustrato soluble Piruvato deshidrogenasa ó Pir. descarboxilasa E1 TPP = Tiamina pirofosfato Dihidrolipoil transacetilasa E2 Lipoamida Coenzima A Dihidrolipoil deshidrogenasa E3 FAD NAD+ TIAMINA Otras enzimas con igual mecanismo: Alfa-cetoglutarato DH, Alfa-cetobutirato DH, cadena ramificada cetoácido DH

Complejo Piruvato deshidrogenasa

Energéticamente muy favorable ( ΔG = -33.5 kJ/mol) y Piruvato Deshidrogenasa Fuente de acetil-CoA para el ciclo del ácido cítrico Cataliza la descarboxilación oxidativa del piruvato. Se usan 4 Vitaminas diferentes como coenzimas Piruvato + NAD+ + CoA-SH <-> Acetyl~CoA + NADH + CO2 Energéticamente muy favorable ( ΔG = -33.5 kJ/mol) y esencialmente irreversible in vivo.

Todo el complejo puede inactivarse con compuestos con arsénico que se unen a sulfhidrilos (como en dihidrolipoamida) R HS As OH -O + R´-As=O S R´ Arsenito Arsenical orgánico

ATP es un inhibidor alostérico del complejo. La actividad del complejo Pir-DH es coordinada por la proporción de Coenzima A acetilada y libre. E2 (componente transacetilasa) Es inhibida por acetil-CoA y activada por CoA-SH. Regulación En mamíferos, E1 del complejo piruvato dehidrogenasa es susceptible de modificación covalente. + Fosforilación de Ser en eucariotas Pir-DH-kinasa (+) y Pir-DH-Fosfatasa (-) E3 (componente Dihidrolipoamida-DH) Es inhibida por NADH y activada por NAD+. La actividad del complejo es coordinada por las relaciones [NADH]/[NAD] y [acetil-CoA]/[CoA] ATP es un inhibidor alostérico del complejo.

Acetil-CoA Se origina en: Glucosa, ácidos grasos y aminoácidos. El enlace tioester posee una alta energía libre de hidrólisis Se origina en: Glucosa, ácidos grasos y aminoácidos. Es precursor de: ácidos grasos, colesterol, aminoácidos y se oxida en el Ciclo de KREBS Aporta los dos C que se van a oxidar en el ciclo del ácido cítrico. Acetil~CoA + H2O  acetato + HS-CoA + H+ ∆G°’ = -32,2 kJ/mol

Respiración aerobia y anaerobia

ORIGEN DEL ACETIL~CoA - Descarboxilación del Piruvato ORIGEN DEL ACETIL~CoA - Descarboxilación del Piruvato. - Oxidación de Ácidos Grasos. - A partir de Aminoácidos cetogénicos.

OTRO DESTINO DEL PIRUVATO Bicarbonato Piruvato OTRO DESTINO DEL PIRUVATO Piruvato Carboxilasa a

Estrategia General y objetivos del Ciclo del Acido Cítrico (C Estrategia General y objetivos del Ciclo del Acido Cítrico (C. de Krebs) En cada vuelta se introducen 2 carbonos (Acetil-CoA), y su equivalente será totalmente oxidado. Se liberan 2 moléculas de CO2. La energía libre de la oxidación se conserva en forma de coenzimas reducidas (NADH y FADH2) y GTP. Los intermediarios se reciclan y pueden dar AA, AG, Colesterol, Glc, Porfirinas, oxidar esqueletos de AA.

Ciclo de Krebs ó de los ácidos tricarboxílicos En el ciclo entra una molécula de acetato (dos átomos de C) salen dos moléculas de CO2 y cuatro pares de hidrógenos. 1 molécula de glucosa -> 2 de acetato (4 C), que se degrada en un proceso cíclico. Una serie de sustancias del ciclo ceden H por pares (2H) a otra (NAD, FAD) reduciéndola (a NADH, FADH2). En cierta forma, el proceso equivale a tener átomos de H que se pueden unir con el O durante la respiración para formar agua.

4 - α-CETOGLUTARATO DH + NAD+: 1 - CITRATO SINTASA Adición de un grupo acetilo (transportado por HS-CoA) al Oxalacetato = Citrato 2 - ACONITASA Cambio de un grupo -OH del Citrato de la posición 3 a la 2, dando Isocitrato 3 - ICDH + NAD+: Deshidrogenación y descarboxilación. Oxidación del -OH del Isocitrato de la posición 2, debilitación y pérdida del -COO- central, dando Oxalosuccinato (alfa-cetoglutarato) 4 - α-CETOGLUTARATO DH + NAD+: Deshidrogenación , descarboxilación y síntesis (Similar a reacción de Piruvato-DH) Por la oxidación se debilita y pierde el –COO- . Ingresa 1 HS-CoA que transporta el Succinato, central, dando Oxalosuccinato (alfa-cetoglutarato) 5 - SUCCINIL-CoA SINTETASA: Hidrólisis del Succinil-CoA, c/liberación de suficiente E p/síntesis de GTP 6 - SUCCINATO DH + FAD+: Oxidación con insaturación del Succinato 7 - FUMARASA + H2O: Hidratación del Fumarato 8 - Malato DH + NAD+: Oxidación del Malato en su grupo alcohol (a carbonilo) reconstituyendo Oxalacetato.

[[Cis-Aconitato] EC 2.3.3.1. EC 4.2.1.3. EC 1.1.1.37. EC 1.1.1.41/42.

Moléculas: Simétrica Asimétricas (quiral)

Glucosa + 2ATP + 4ADP + 2Pi + 2NAD+ 2 Ácido pirúvico + 2ADP + 4ATP + 2NADH + 2H+ + 2 H2O Balance 2 Piruvatos + 2 HS-CoA + 2 NAD + 2 Ácetil~S-CoA + 2CO2 + 2NADH + 2H+ +

C6H12O6 + 6O2=> 6CO2 + 6H2O G = -686 kcal/mol 180 g (1 mol) Glucosa son oxidados por 192 g (6 moles) de oxígeno y se forman 264 g (6 moles) de CO2 Glucosa + Oxígeno => Dióxido de Carbono + Agua + Energía o bien, C6H12O6 + 6O2=> 6CO2 + 6H2O G = -686 kcal/mol

*Calculando según: 2,5 ATP por NADH y 1,5 ATP por FADH2. Formación de ATP en la Glucólisis, descarboxilación oxidativa del Piruvato, Ciclo de Krebs y Sistema acoplado de Cadena Respiratoria-Fosforilación Oxidativa. Sustratos Productos *ATP Glucosa Glc-6-P -1ATP -1 Fructosa-6-P Fru-1,6-diP 2 Gliceraldehidos-1,3-diP 2 1,3-diP-Gliceratos 2NADH 3,5 2 3-P-Gliceratos 2 ATP 2 2 PEP 2 Piruvatos 2 Acetil-CoA 2 NADH 5 2 Isocitratos 2 α-Cetoglutaratos 2 Succinil-CoA 2 Succinatos 2 ATP (2 GTP) 2 Fumaratos 2 FADH2 3 2 Malatos 2 Oxaloacetatos TOTAL 30-32 *Calculando según: 2,5 ATP por NADH y 1,5 ATP por FADH2.

La metabolización de la Glc libera E que es capturada en moléculas de ATP (ó 30-32) 30

Se metaboliza tanta Glc requiera el Ciclo de Krebs La velocidad de la Glucólisis y la del Ciclo de Krebs (que consume Acetil-CoA) están integrados (bajo condiciones normales) por: Inhibición por altos niveles de ATP y NADH (componentes comunes de ambas vías); y Por la concentración de Citrato (producido en Krebs que inhibe la Fosfofructoquinasa de la Glucólisis) Se metaboliza tanta Glc requiera el Ciclo de Krebs

Carácter Anfibólico del Ciclo del Acido Cítrico Algunos intermediarios del ciclo son precursores y/o derivados de otros compuestos

Retiro de intermediarios hacia vías anabólicas Reposición anaplerótica de intermediarios agotados. Las reacciones de transaminación y desaminación de AA son reversibles, por lo que su dirección varía en función de la demanda metabólica.

Remoción de intermediarios puede saturarse. Tips del Ciclo de Krebs biosintético ahorro de energía Remoción de intermediarios puede saturarse. Única vía enzimática saturable azúcares ácidos grasos En la respiración aeróbica se conserva aprox. el 42 % de la energía de la glucosa en forma de ATP. 288 Kcal * mol-1 (1205 KJ* mol-1 ) Es una reacción fuertemente exergónica, con una energía libre ( G°) negativa. Se puede calcular el rendimiento de la siguiente forma: 288/ 686 x 100= 42 %. 36

TERMODINAMICA Y BIOENERGÉTICA

Bioenergética: leyes de la termodinámica -Estudia las transformaciones de energía que tienen lugar en la célula. -Naturaleza y función de los procesos químicos en los que se transforma la energía en seres vivos.

Necesitan de energía p/sus actividades CÉLULAS Necesitan de energía p/sus actividades (desarrollo, crecimiento, renovación de estructuras, síntesis de moléculas, etc). Según la fuente de carbonos: Autótrofos: Pueden utilizar el CO2 como fuente de C (bacterias, vegetales). Heterótrofos: obtienen C de moléculas orgánicas complejas (animales, microorganismos). CÉLULA ANIMAL Energía química para realizar trabajo proviene de la oxidación de sustancias incorporadas como alimentos (carbohidratos, grasas).

Metabolismo: “rutas metabólicas” Catabolismo: Anabolismo: Fase de suma de las reacciones químicas que ocurren en la célula (organizadas en series de reacciones catalizadas) = “rutas metabólicas” Fase de degradación Fase de síntesis ATP ADP NADPH+H+ NADP+ Catabolismo: Las moléculas nutrientes se convierten en otras mas pequeñas y simples. Anabolismo: moléculas pequeñas reaccionan para convertirse en otras más grandes y complejas.

En una transformación química, gralmente se rompen enlaces y el contenido de energía (E) de las moléculas aumenta o disminuye (DG aumenta o disminuye). “Moneda” de intercambio de Energía en los procesos biológicos = ATP

Beta-Oxidación y Krebs NADH, NADPH y FADH2 son los principales transportadores de electrones, ya que sufren oxidaciones y/o reducciones reversibles. Sus reducciones, permiten la conservación de la Energía Libre que se produce en la oxidación de los sustratos Ana l og í as Na t u r a l es

DEFINICIONES ENERGÍA: Es la “capacidad para producir un trabajo”. SISTEMA: “ toda porción del universo que se somete a estudio” MEDIO: “es lo que rodea al sistema” UNIVERSO = SISTEMA + MEDIO

EQUILIBRIO QUÍMICO Keq = [C][D] / [A][B] Para cada reacción química, el valor de la Keq es característico a una Tº dada. Si Keq >1, la reacción se encuentra desplazada hacia Si Keq <1, la reacción se encuentra desplazada hacia si Keq =1, la reacción se encuentra en Equilibrio y no hay desplazamiento neto. En seres vivos las reacciones se desplazan del equilibrio.

PRINCIPIOS DE LA TERMODINÁMICA PRIMER PRINCIPIO: “ LA ENERGÍA TOTAL DEL UNIVERSO PERMANECE CONSTANTE” Equivale a decir: la energía del universo no se crea ni se destruye, permanece invariante. Solo se transforma. SEGUNDO PRINCIPIO: “ LA ENTROPÍA DEL UNIVERSO AUMENTA” Equivale a decir que el grado de desorden en el universo aumenta.

DEFINICIONES ENTALPÍA (DH): es la energía en forma de calor, liberada o consumida en un sistema a ,T y P constantes. ENTROPÍA (DS): energía no degradada, no utilizada para realizar trabajo. ENERGÍA LIBRE (DG): Representa la energía intercambiada en una reacción química. Es la energía disponible para realizar trabajo.

Dirección de una reacción A una temperatura dada la espontaneidad de una reacción dependerá del balance entre dos tendencias, pudiendo determinarse relacionando las propiedades termodinámicas de entalpia (∆H) y entropía (∆S). ∆H = está en relación a la energía requerida para romper enlaces químicos (tendencia a formar los enlaces más fuertes posible). ∆S = está relacionado con el grado de dispersión de la materia y la energía (tendencia a dispersarse, al mayor desorden). De acuerdo a la termodinámica, la dirección preferencial para una reacción está determinada por el compromiso entre las tendencias hacia enlaces más fuertes y mayor desorden. Se dice, entonces, que la diferencia entre ∆H y T∆S equivale a una cierta cantidad de energía útil para hacer trabajo, la que se denomina como energía libre y se simboliza con la letra G. Esta propiedad del sistema se conoce comúnmente como la energía libre de Gibbs.

CAMBIOS DE ENERGÍA LIBRE EN LAS REACCIONES QUÍMICAS Fundamentalmente sólo hay dos razones por la que ocurre una reacción química: (1) la tendencia a lograr el mínimo de energía (2) la tendencia a lograr el máximo desorden Medir el contenido de energía de un sistema es muy difícil, generalmente se mide el cambio de energía entre dos estados. La variación de energía (DG) para ir de A hacia B es: DGBA = GB - GA Para ir de B hacia A: DGAB = GA – GB = - DGBA Matemáticamente: DG = DH -TDS

CAMBIOS DE ENERGÍA LIBRE EN LAS REACCIONES QUÍMICAS DGº es la variación de Energía Libre en condiciones estándar (Tº= 298ºK,[ ] = 1M,P = 1atm) DGº’ es la variación de energía libre estándar a un pH próximo al fisiológico (pH = 7) R = 1,987 cal/mol grado

PROCESO EXOTÉRMICO: es aquel que transcurre con liberación de calor al medio. PROCESO ENDOTÉRMICO: el que transcurre tomando calor del medio. PROCESO EXERGÓNICO: libera energía. (ESPONTANEO) PROCESO ENDERGÓNICO: absorbe energía. (NO ESPONTANEO)

E libre ó E de Gibbs (G) G = Gfinal – Ginicial Función más importante en Bioquímica Proceso real o factible = cambio de E libre de Gibbs negativo (-G) G = Gfinal – Ginicial G < 0 (FACTIBLE y EXERGÓNICO) G = 0 (ISOERGÓNICO-en equilibrio) G > 0 (NO FACTIBLE y ENDERGÓNICO) REACCIONES CON: -G = son exergónicas y espontáneas a derecha +G = endergónicas e inviables a derecha – pero pueden ser viables por acoplamiento energético con las exergónicas

COMPUESTOS DE ALTA ENERGÍA Compuestos c/Patos ∆G° de hidrólisis, en kJ/mol Fosfoenolpiruvato (-61.9) 1,3-bifosfoglicerato (-49.3) Fosfocreatina (-43.0) ATP (-30.5) ADP Glucosa-1-fosfáto (-20.9) Glucosa-6-fosfáto (-13.8)

ATP Es el compuesto de alta energía de mayor importancia en la célula. El ATP a pH fisiológico se encuentra como ATP4-. Las 4 cargas negativas se encuentran próximas y originan tensiones intramoleculares que desaparecen al hidrolizarse en ADP+Pi o AMP+PPi. Además los productos de la hidrólisis se solvatan mejor y se estabilizan por resonancia contribuyendo a disminuir DG y desplazando la reacción hacia

Transferencia de energía en el metabolismo celular P (grupos fosfato) = conservación y transferencia de E 1,3-Bis-P-Glicerato y 2P-PEP ceden E al ADP->ATP Creatín-P y Arginín-P = reservas de E p/cederla al ATP (en tejidos con mayores requerimientos temporales como el músculo) Fosforilación oxidativa: transforma ADP en ATP (c/E liberada por oxidación de coenzimas reducidas)

Desde el punto de vista energético, una reacción con un DG positivo no podría ocurrir a no ser que exista un aporte de energía que la haga posible. Dicho aporte, lo proveen compuestos de alto contenido energético, que se caracterizan por tener enlaces que al romperse liberan una alta cantidad de energía. Este proceso se llama acoplamiento. MOLECULAS DE ALTA ENERGIA : ATP, Acetil-CoA, Creatina Fosfato, Fosfoenol Piruvato, por ejemplo.

Reacciones acopladas Las Enzimas pueden combinar reacciones exergónicas con endergónicas para resultar en una reacción acoplada que en conjunto es exergónica (reacción espontánea).

REACCIONES ENERGÉTICAMENTE ACOPLADAS Una reacción altamente exergónica puede hacer que otra endergónica ocurra si ambas se acoplan. nombre DGº’(kcal/mol) ATP ADP + P -7,3 ADP AMP + P -7,7 AMP adenosina + P -3,4

GLUCOSA + ATP  GLUCOSA-6-P + ADP ∆G°’ = -7,3 + 3,3 = -4,0 Kcal/mol “Los valores de DGº de reacciones secuenciales son aditivos” Este principio explica por que una reacción termodinámicamente desfavorable puede ocurrir, si se acopla a otra reacción que sea exergónica, a través de un intermediario común GLUCOSA + ATP  GLUCOSA-6-P + ADP ∆G°’ = -7,3 + 3,3 = -4,0 Kcal/mol

ACTIVACION Es la unión de moléculas biológicas de modo tal que, la ruptura de ese enlace químico formado, tiene un DG <0 Ejs: 1) A + COENZIMA A-COENZIMA A-COENZIMA + B AB + COENZIMA DG<0 2) FOSFORILACION

Estructura química de la Acetil CoA Estructura química de la Acetil CoA. El grupo acetilo aparece a la izquierda de la figura, unido al azufre (S) ADENOSINA ÁCIDO PANTOTÉNICO CISTEÍNA

La Coenzima A es un transportador de grupos acilo. Al grupo sulfhidrilo terminal, se unen los grupos acilo mediante un enlace tioester. La hidrólisis de un tioester es muy favorable termodinámicamente, lo que hace que esta molécula tenga un alto potencial de transferencia de grupos acilo. La CoA es un “transportador de acilos activado” igual que el ATP es “un transportador de P activado”.