EVIDENCIA EX VIVO E IN VIVO DEL EFECTO PROLIFERADOR DE LA 1,25(OH)2D3 SOBRE LAS CMLV. PAPEL MEDIADOR DEL VEGF

CMLV Cultivo primario + Métodos calcitriol Factor trófico: FGF Concentraciones diferentes calcitriol CMLV de aorta de rata Sprague-Dawley + Factor trófico: FGF CMLV Cultivo primario

Efecto del calcitriol en la expresión de VDR 0 h 12 h 16 h 24 h - + - + - + - 1,25(OH)2D3 (100nM) 51 kD * * VDR expression (%)

Efecto del calcitriol en la proliferación de las CMLV in vitro  *  #  #  % over control % over control 1,25(OH)2D3 (nM) 1,25(OH)2D3 (nM) bFGF (ng/mL) bFGF (ng/mL) 20 20 20 20 20

Efecto del calcitriol en la progresión del ciclo celular de las CMLV in vitro 6.9% IN S PHASE 11.1% 27.9% 6.7% 24.9% 55.2% 16 22 TIME (HOURS) WITHOUT 1,25(OH)2D3 WITH 100nM 1,25(OH)2D3

Efecto del calcitriol en la expresión de VEGF en las CMLV in vitro * * * VEGF expression % pmols/4000 cells

Efecto del VGA1102 en la proliferación de CMLV inducida por calcitriol MTT Assay % over control % over control * 1,25(OH)2D3 (100nM) + + - - VGA1102 (1mM) - + + -

Efecto de anticuerpos anti-VEGF en la proliferación de CMLV inducida por calcitriol * % over control + + - - 1,25(OH)2D3 (100nM) - + + - Anti VEGF (0.6 mg/mL)

Posible VDRE en el gen del VEGF 7201 CTGGGCCCGTAAGCATTTACTAACTACTCTCCCTGCTAAAAGAGAGCCATCCGGGAGGTG 7260 7261 ACTCAGGGCAGCTATGATAGGCCAGATGGGATGGGGTGGCTTTTTTCCTCATAAGATCCT 7320 7321 CATAACATTGCTCCATTGAAATTGGGGTTCCCAACAGGTACCAGCATCCCACGGAGCCTC 7380 7381 AGTACTGTGTGCAGAGGGATGGAGATGGTGGAGTAACCTTTTCGGGGGACCAGTAGGAAG 7440 7441 ACTGTTGGCTCCCTTTCTCAGAAGCTCAGCAGACCTGGGTGAGGGCTGGGACTGGTTGGT 7500 7501 CCCTCTCTTCCCACAGGTATCAGAGCCCCCTCTTGTTCCCAGGGGAGCCTAGGAGCAGCT 7560 7561 GGGCCAAAGCCCAACCAGGAATTTTTCCAGGCTGGTTCCTATATCCAAGGGTGGGCTGGA 7620 7621 GGTGGGGGCTTTGGGGAGCTCTTAAGGAAGACACGAGGAGGTGAAGGGGACTTTGTGGAA 7680 ------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------ 9721 CCTGGAGAAGCCGGGGCCCGAGAAGAGAGGGGAGAAAGAGAAGGAAGAGGAGAGGGGGCC 9780 9781 GCAGTGGGCGCTCGGCTCTCGGGAGCCGGGCTCATGGACGGGTGAGGCGGCGGTGTGCGC 9840 9841 AGACAGTGCTCCAGCCGCGCGCGCGCCCCAGGCCCCGGCCCGGGCCTCGGTTCCAGAAGG 9900 9901 GAGAGGAGCCCGCCAAGGCGCGCAAGAGAGCGGGCTGCCTCGCAGTCCGAGCCGGAGAGG 9960 9961 GAGCGCGAGCCGCGCCGGCCCCGGACGGGCCTCTGAAACCATGAACTTTCTGCTCTCTTG 10020 10021 GGTGCACTGGACCCTGGCTTTACTGCTGTACCTCCACCATGCCAAGGTAAGCGGTCGTGC 10080

CMLV Ex vivo Métodos calcitriol Anillos de aorta de rata Sprague-Dawley calcitriol CMLV Ex vivo

Efecto del calcitriol en la proliferación de las CMLV ex vivo B1 * % of positive nucleus A2 B2

CMLV in vivo Métodos calcitriol Rata Sprague-Dawley Con 5/6 de reducción de masa renal CMLV in vivo 8 semanas calcitriol

Efecto del calcitriol en la proliferación de las CMLV in vivo B1 Control vit D 1 mg/kg * B % of positive nucleus A2 B2

Efecto del calcitriol en la arquitectura de la aorta Area of the media Media/lumen ratio * mm2 No treatment Calcitriol 1 mg/kg No treatment Calcitriol 1 mg/kg

Conclusión El calcitriol induce un aumento en la proliferación de las CMLV in vitro e in vivo. Este efecto está mediado por un aumento en la expresión de VEGF. El aumento de proliferación de las CMLV in vivo produce un cambio en la arquitectura vascular.