PURIFICACIÓNDE PROTEÍNAS Semestre 2011-I 16 Agosto 2010

La estructura y función de una proteína está dada por su composición de aminoácidos POR TANTO, por la secuencia de DNA del gen que la codifica. Código genético

Las proteínas son macromoléculas formadas por cadenas lineales de aminoácidos ¿Qué es un aminoácido? ¿Cómo se llama el enlace que une dos aminoácidos?

LAS PROTEÍNAS SON VITALES PARA EL BUEN FUNCIONAMIENTO CELULAR FUNCIÓN EJEMPLOS Catálisis Enzimas : proteasas, polimerasas, cinasas Defensa Inmunoglobulinas, anticuerpos, toxinas Transporte Hemoglobina, mioglobina, canales membranales Soporte Colágeno, queratina Movimiento Actina, miosina Regulación Factores de transcripción (proteínas de unión al DNA) Señalización Hormonas (insulina)

¿ PARA QUÉ NECESITAMOS PURIFICAR PROTEÍNAS? Para la producción de anticuerpos ESTUDIAR SU FUNCIÓN y regulación enzimática REALIZAR ANÁLISIS ESTRUCTURALES: cristalografía de rayos X, espectroscopía NMR. Estudiar sus interacciones con otras proteínas o con ácidos nucleícos Si no se conoce el gen que codifica a la proteína aislada: La proteína purificada se puede usar para determinar la secuencia de aminoácidos y por tanto la secuencia del gen que la codifica!!!!

Usos terapeúticos , estudios in vivo ANTES DE EMPEZAR!!!! 1. Seleccionar la muestra biológica (fuente) 2. Definir objetivos: PUREZA Y CANTIDAD REQUERIDA Muy alta > 99% Usos terapeúticos , estudios in vivo Alta 95-99% Cristalografía de rayos X, Caracterización fisicoquímica Moderada <95% Obtención de antigeno(s) para la producción de anticuerpos Secuenciación

2. Propiedades iónicas (punto isoeléctrico) ANTES DE EMPEZAR!!!! 3. Investigar las PROPIEDADES de la proteína que se desea purificar ¿? 1. Tamaño 2. Propiedades iónicas (punto isoeléctrico) 3. Hidrofobicidad (solubilidad) 4. Estabilidad (temperatura, pH, oxidación-reducción) 5. Afinidad por un ligando maño

Cuantificación de proteína total ANTES DE EMPEZAR!!!! 4. Contar con un método adecuado para la detección de la proteína de interés. Monitorear el progreso de la purificación y ESTAR SEGUROS QUE SE ESTÁ PURIFICANDO LA PROTEÍNA DE INTERÉS Cuantificación de proteína total Detectar específicamente la proteína de interés: por ejemplo ensayos de actividad, ensayos inmunológicos, SDS-PAGE

PARA PURIFICAR UNA PROTEÍNA ES NECESARIO REALIZAR VARIAS PASOS Al final de la práctica aprenderemos a hacer e interpretar un CUADRO DE PURIFICACIÓN

A PURIFICAR SE HA DICHO!!!!! 1. Ya seleccionamos la muestra biológica (fuente) El primer paso en el aislamiento de una proteína es la rotura celular. El método seleccionado dependerá de la naturaleza del tejido y/o células

MÉTODOS PARA REALIZAR LA ROTURA CELULAR 1. Lisis celular válido para células sin pared celular como las células de tejidos animales, pero no es suficiente para células vegetales o bacterias. Congelación-descongelación, prensa de French, sonicación, macerado con N2 líquido 2. Destrucción mecánica 3. Lisis con detergentes

muchos agentes que pueden dañarla!!!!!!. UTILIZAR: Una vez que la proteína se ha extraído de su entorno natural está expuesta a muchos agentes que pueden dañarla!!!!!!. UTILIZAR: Soluciones amortiguadoras. Inhibidores de proteasas Bajas temperaturas (4°C) EVITAR Altas temperaturas Manipular demasiado la muestra PROCURAR que el proceso sea lo más corto posible. Dibujo de proteasas

El resultado de la lisis celular es un lisado u homogenado que contiene una mezcla de proteínas, membranas y células rotas. Esta preparación se somete a centrifugación La fase soluble constituye el extracto crudo donde se encuentra la proteína de interés

OBTENCIÓN DEL EXTRACTO CRUDO

DEFINICION CENTRIFUGACION Centrifugación DEFINICION CENTRIFUGACION

CENTRIFUCACIÓN DIFERENCIAL VARIOS PASOS SECUENCIALES DE CENTRIFUGACIÓN A DIFERENTES VELOCIDADES La centrifugación diferencial se basa en la existencia de diferentes partículas en la suspensión que difieren en su densidad de la del medio.

PARÁMETROS QUE SE DEBEN CONSIDERAR EN CUALQUIER CENTRIFUGACIÓN, SON: Volumen de solución a centrifugar para determinar el tipo de tubo y rotor a emplear. Naturaleza química de la solución para determinar la clase de tubo a emplear. La diferencia de densidad entre la partícula a sedimentar y la densidad del medio en el que se encuentra. En general cuanto mayor sea la diferencia de densidad se utilizará poco tiempo y poca fuerza de aceleración. Cuando el diferencial es muy pequeño se pueden aplicar centrifugaciones de cientos de miles de g durante horas.

Métodos de purificación de proteínas Precipitación con sales, precipitación con temperatura y pH BAJA RESOLUCIÓN Métodos cromatográficos: filtración en gel, intercambio iónico, afinidad Métodos electroforéticos: electroforesis no desnaturalizante, desnaturalizante, isoelectroenfoque ALTA RESOLUCIÓN

Precipitación con sales Sal más usada: Sulfato de Amonio

EXISTEN TABLAS QUE ESPECIFICAN LA CANTIDAD DE SULFATO DE AMONIO QUE SE DEBE AGREGAR PARA LLEGAR A UN % DE SATURACIÓN ESPECÍFICO