PURIFICACIÓNDE PROTEÍNAS Semestre 2013-2 Febrero 12 2013

Las proteínas son macromoléculas formadas por cadenas lineales de aminoácidos ¿Qué es un aminoácido? ¿Cómo se llama el enlace que une dos aminoácidos?

LAS PROTEÍNAS SON VITALES PARA EL BUEN FUNCIONAMIENTO CELULAR FUNCIÓN EJEMPLOS Catálisis Defensa Transporte Soporte Movimiento Regulación Señalización

LAS PROTEÍNAS SON VITALES PARA EL BUEN FUNCIONAMIENTO CELULAR FUNCIÓN EJEMPLOS Catálisis Enzimas : proteasas, polimerasas, cinasas Defensa Inmunoglobulinas, anticuerpos, toxinas Transporte Hemoglobina, mioglobina, canales membranales Soporte Colágeno, queratina Movimiento Actina, miosina Regulación Factores de transcripción (proteínas de unión al DNA) Señalización Hormonas (insulina)

¿ PARA QUÉ NECESITAMOS PURIFICAR PROTEÍNAS? Para la producción de anticuerpos ESTUDIAR SU FUNCIÓN y regulación enzimática REALIZAR ANÁLISIS ESTRUCTURALES: cristalografía de rayos X, espectroscopía NMR. Estudiar sus interacciones con otras proteínas o con ácidos nucleícos Si no se conoce el gen que codifica a la proteína aislada: La proteína purificada se puede usar para determinar la secuencia de aminoácidos y por tanto la secuencia del gen que la codifica!!!!

ANTES DE EMPEZAR!!!! 1. Seleccionar la muestra biológica (fuente) 2. Definir objetivos: PUREZA Y CANTIDAD REQUERIDA Muy alta > 99% Usos terapeúticos , estudios in vivo Alta > 95-99% Estudios estructurales, cristalografía de rayos X, Caracterización fisicoquímica Moderada > 95% Obtención de antigeno(s) para la producción de anticuerpos Secuenciación Espectrometría de masas

ANTES DE EMPEZAR!!!! 2. Definir objetivos: PUREZA Y CANTIDAD REQUERIDA

2. Propiedades iónicas (punto isoeléctrico) ANTES DE EMPEZAR!!!! 3. Investigar las PROPIEDADES de la proteína que se desea purificar 1. Tamaño 2. Propiedades iónicas (punto isoeléctrico) 3. Hidrofobicidad (solubilidad) 4. Estabilidad (temperatura, pH, oxidación-reducción) 5. Afinidad por un ligando maño

Monitorear el progreso de la purificación ANTES DE EMPEZAR!!!! 4. Contar con un método adecuado para la detección de la proteína de interés. Monitorear el progreso de la purificación Cuantificación de proteína total Detectar específicamente la proteína de interés

SDS-PAGE: una técnica utilizada ampliamente para monitorear el progreso de una purificación

PARA PURIFICAR UNA PROTEÍNA ES NECESARIO REALIZAR VARIAS PASOS Fase I. El objetivo inicial es la obtención del homogeneizado o extracto crudo y su clarificación o concentración. Fase II. El objetivo principal es eliminar una cantidad importante de contaminantes que pueden ser proteínas, ácidos nucleicos, toxinas y virus. Uno de los métodos más utilizados para eliminar proteínas contaminantes es el de la precipitación. Fase III. El objetivo es obtener una proteína pura o con mínimas trazas de contaminantes. Para alcanzar el objetivo se utilizan uno o la combinación de varios métodos cromatográficos, como la cromatografía de exclusión molecular, intercambio iónico, interacción hidrofóbica y de afinidad.

PARA PURIFICAR UNA PROTEÍNA ES NECESARIO REALIZAR VARIAS PASOS Al final de la práctica aprenderemos a hacer e interpretar un CUADRO DE PURIFICACIÓN

A PURIFICAR SE HA DICHO!!!!! 1. Ya seleccionamos la muestra biológica (fuente) ¿Cuál es el primer paso?

MÉTODOS PARA REALIZAR LA ROTURA CELULAR Algunos ejemplos son: 1. Lisis celular válido para células sin pared celular como las células de tejidos animales, pero no es suficiente para células vegetales o bacterias. Congelación-descongelación, prensa de French, sonicación, macerado con N2 líquido 2. Destrucción mecánica 3. Lisis con detergentes

¿Cómo protegemos a la proteína de interés? Una vez que la proteína se ha extraído de su entorno natural está expuesta a muchos agentes que pueden dañarla!!!!!!. ¿Cómo protegemos a la proteína de interés?

Soluciones amortiguadoras Inhibidores de proteasas UTILIZAR: Soluciones amortiguadoras Inhibidores de proteasas Bajas temperaturas (4°C) EVITAR Altas temperaturas Manipular demasiado la muestra PROCURAR que el proceso sea lo más corto posible.

Algunos agentes estabilizadores son:

El resultado de la lisis celular es un lisado u homogenado que contiene una mezcla de proteínas, membranas y células rotas. Esta preparación se somete a filtración y/o centrifugación Para obtener el clarificado

OBTENCIÓN DEL EXTRACTO CRUDO

Centrifugación

CENTRIFUCACIÓN DIFERENCIAL VARIOS PASOS SECUENCIALES DE CENTRIFUGACIÓN A DIFERENTES VELOCIDADES La centrifugación diferencial se basa en la existencia de diferentes partículas en la suspensión que difieren en su densidad de la del medio.

Métodos de purificación de proteínas Precipitación con sales, precipitación con temperatura y pH BAJA RESOLUCIÓN Métodos cromatográficos: filtración en gel, intercambio iónico, afinidad Métodos electroforéticos: electroforesis no desnaturalizante, desnaturalizante, isoelectroenfoque ALTA RESOLUCIÓN

Precipitación con sales Sal más usada: Sulfato de Amonio

EXISTEN TABLAS QUE ESPECIFICAN LA CANTIDAD DE SULFATO DE AMONIO QUE SE DEBE AGREGAR PARA LLEGAR A UN % DE SATURACIÓN ESPECÍFICO

Lactato deshidrogenasa (LDH) Oxidorreductasa que cataliza la reducción del piruvato a lactato gracias a la oxidación de NADH a NAD+. Piruvato + NADH Lactato + NAD+ LDH

LDH - Isoenzimas La LDH es un tetrámero Las cinco isoenzimas se han enumerado del 1 al 5 en función de su movilidad electroforética. Así la LDH-1 (H4) es la que más avanza hacia el ánodo mientras que la LDH-5 (M4) es la de menor movilidad electroforética.

LDH - Isoenzimas LDH - 1 (H4): en el corazón, músculos y eritrocitos. LDH - 2 (H3M): en el sistema retículo endotelial y leucocitos. LDH - 3 (H2M2): en los pulmones. LDH - 4 (HM3): en los riñones, placenta y páncreas. LDH - 5 (M4): en el hígado y músculo esquelético. Todas las isoenzimas pueden unir 4 moléculas de coenzima

LDH Vida media de 144 horas. Peso molecular es de aproximadamente 140 kDa, cada subunidad pesa aproximadamente 35 kDa. EC. 1.1.1.27 - Clase : 1 (oxidorreductasa) - Subclase : 1 (actúa sobre un sustrato que posee un grupo CH-OH como donador de electrones) - Subsubclase : 1 (NAD+ o NADP+ es el coenzima aceptor) - Orden dentro de la subsubclase : 27 (número de enzima en este grupo)