2. Estructura y Propiedades de Proteínas Purificación de LDH de músculo de Gallus gallus

Ciclo de Cori ↑Demanda de ATP ↓O2 Hígado Sangre Músculo Glucosa Piruvato NADH Lactato deshidrogenasa (LDH) L-Lactato NAD+ Hígado Sangre Músculo Glucosa Glucógeno L-Lactato ATP + GTP ADP + GDP + Pi ADP + Pi ATP Glucogenolisis y Glucólisis Gluconeogénesis

2. Purificación de la enzima lactato deshidrogenasa de músculo esquelético de bovino PARTE I. EXTRACCIÓN Y PRECIPITACIÓN POR SALADO.

¿Para qué purificar una proteína? Lipasa Hexosa oxidasa Vacuna Hepatitis B Insulina Gelatina Proteínas recombinantes varias Pectinoesterasas Suero fetal bovino Colorante de carne Proteína liofilizada

¿Por qué Queremos Purificar una Proteína? Precisar secuencias de aminoácidos. Establecer relaciones evolutivas. Investigar la función bioquímica. Establecer relaciones estructura-función. Aplicaciones terapéuticas o biotecnológicas

GUIA PARA PURIFICAR UNA PROTEÍNA Definir los objetivos. Pureza, actividad y cantidad. Definir las propiedades de la proteína de interés e impurezas. PM, pI, solubilidad, estabilidad. Componentes que puedan dañar a las proteínas (ejm proteasas). Seleccionar la fuente de proteína. Organismo, tejido, localización celular. Desarrollar una técnica de análisis. Para una detección rápida de la actividad de la proteína.

GUIA PARA PURIFICAR UNA PROTEÍNA Minimizar el manejo de la muestra. Evitar procedimientos largos. Minimizar el uso de aditivos. Usar lo mínimo necesario. Eliminar los contaminantes dañinos rápidamente. Por ejemplo, las proteasas. Usar una técnica diferente en cada paso. Con el fin de aprovechar al máximo las características de la muestra en el proceso de separación.

GUIA PARA PURIFICAR UNA PROTEÍNA Reducir el número de pasos. Los pasos extra reducen el rendimiento e incrementan el tiempo de purificación.

Fases de la Purificación Fase I ó fase de captura, el objetivo es aislar, concentrar y estabilizar la proteína de interés. Se deben de eliminar los contaminantes críticos que comprometan la estabilidad de la proteína. Fase II ó fase intermedia, el objetivo es eliminar la mayoría de las impurezas como otras proteínas, ácidos nucléicos, endotoxinas y virus. Fase III ó fase de perfeccionamiento, la mayoría de las impurezas ya han sido removidas excepto aquellas que están muy relacionadas con la proteína de interés y que se encuentran en cantidades muy pequeñas. El objetivo es logar la mayor pureza posible.

Definir las Propiedades de la Proteína de Interés La información es útil para detectar la proteína a través de SDS-PAGE, también es importante cuando seleccionamos un método de filtración en gel. Peso Molecular El conocer el valor del pI puede ser utilizado con diferentes propósitos: pp isoeléctrica, selección de columna de intercambio iónico, pH de trabajo. pI Afectada por temperatura, pH, fuerza iónica. Esto debe ser considerado para evitar la agregación y precipitación de la proteína. También útil para separación. Solubilidad Hidrofobicidad e hidrofilicidad de la muestra, para elegir una columna de interacción hidrofóbica. Polaridad Ligandos útiles para separar la proteína. Unión Específica En términos de actividad, agregación y composición de subunidades. Las características físicas y químicas de la proteína son importantes a lo largo del proceso. Estabilidad

Seleccionar la Fuente de Proteína La elección de la procedencia de la proteína debe basarse en criterios tales como: la facilidad de obtener cantidades suficientes del tejido del que se aísla la proteína, la cantidad de la proteína de interés en el tejido y cualquier propiedad peculiar de la proteína escogida, que ayudará en su estabilización y su aislamiento.

Ruptura de la Célula ¿Qué Propiedad de la Proteína es Importante Ruptura de la Célula ¿Qué Propiedad de la Proteína es Importante? ESTABILIDAD Las proteínas se desnaturalizan fácilmente por temperaturas elevadas, aunque algunas se pueden desnaturalizar a 25°C. La purificación de las proteínas debe llevarse a cabo a 0°C ó temperaturas cercanas. MÉTODOS Suaves: Lisis celular (choque osmótico) Digestión enzimática (lisozima) Lisis química (detergentes) Homogenización manual Molienda Menos agresivos, previenen desnaturalización de la proteína, pero no aseguran su liberación celular.

Ruptura de la Célula ¿Qué Propiedad de la Proteína es Importante Ruptura de la Célula ¿Qué Propiedad de la Proteína es Importante? ESTABILIDAD MÉTODOS Moderados: Homogenización con cuchillas Molienda abrasiva Congelamiento   Vigorosos: Ultrasonicación Homogenizador Manton-Gaulin Prensa francesa Reducen viscosidad del extracto, pero pueden inactivar proteínas.

Seleccionar la Fuente de Proteína Buffer de Lisis Debe mantener las condiciones apropiadas para mantener e incluso mejorar la estabilidad de la proteína. pH Debe ser al menos una unidad arriba o abajo del pI de la proteína. Ésta diferencia previene la pp isoeléctrica, por el mantenimiento de cargas positivas o negativas en la proteína. Fuerza Iónica Incrementar la fuerza iónica del medio puede reducir las interacciones iónicas entre las proteínas y las pérdidas por pp. Aditivos Son componentes que previenen la degradación y mejoran la estabilidad. Se deben agregar solo si es necesario.

Seleccionar la Fuente de Proteína Aditivos

Fraccionamiento Celular: Centrifugación Diferencial Eliminar contaminantes o clarificar la muestra Separación de los componentes con base en las diferencias en densidad, tamaño y forma. Como resultado, el efecto de la gravedad para cada proteína es diferente. Partículas más grandes y pesadas migran más rápido.

Fraccionamiento Celular: Centrifugación Diferencial Homogenización del tejido Baja velocidad de centrifugación (1 000 g, 10’) Sobrenadante sujeto a velocidad de centrifugación media (20 000 g, 20’) Sobrenadante sujeto a velocidad de centrifugación alta (80 000 g, 1 h) Sobrenadante sujeto a velocidad de centrifugación muy alta (150 000 g, 3 h) Sobrenadante contiene proteínas solubles Tejido homogenado Pellet, contiene células completas, núcleos, membranas plasmáticas Pellet, contiene mitocondrias, lisosomas, peroxisomas Pellet, contiene microsomas (fragmentos de RE), vesículas pequeñas Pellet, contiene ribosomas, macromoléculas grandes Diagrama para la obtención de diferentes fracciones celulares

Fraccionamiento Celular: Gradiente de Densidad Centrifugación Muestra Gradiente de Sacarosa Componentes menos densos Componentes más densos Fraccionamiento Otros compuestos utilizados para formar el gradiente: detergentes no iónicos, Ficoll, Percoll, Nycodenz y Optiprep.  

Remover contaminantes y/o Concentrar la Muestra Después de romper las células y estabilizar las proteínas, el siguiente paso es concentrar. Se pueden utilizar diferentes métodos: Ultrafiltración Liofilización Precipitación

Precipitación ¿Qué propiedad de la proteína es importante? SOLUBILIDAD La solubilidad de una proteína es sensible a la temperatura, el pH, la fuerza iónica. Si afectamos alguna de éstos factores podemos disminuir o incrementar la solubilidad de la proteína. El método más comúnmente empleado es la precipitación por salado con (NH4)2SO4. ¡Y es el que vamos a hacer en la práctica! Sin embargo, también hay otros métodos… Pp con solventes orgánicos. Pp isoeléctrica. Pp térmica.

Precipitación ¿Qué propiedad de la proteína es importante? SOLUBILIDAD Fuerza Iónica Log (S/S’)

Precipitación ¿Qué propiedad de la proteína es importante? SOLUBILIDAD Capa de Hidratación Salting in Salting out Concentración de sal

Precipitación ¿Qué propiedad de la proteína es importante? SOLUBILIDAD

Existen tablas que nos indican cuanto añadir de sulfato de amonio

Y también en internet http://www.proteinchemist.com/cgi-bin/s2.pl Conocer: Sulfato de amonio sólido Conocer el volumen de la solución Y la concentración final de la sal

¿Cómo vamos a purificar a la LDH de Gallus gallus?

Propiedades de LDH de Gallus gallus LDH A LDH B Numero de aminoácidos 332 333 Peso molecular (Da) 36514.4 36318.0 Punto isoeléctrico 7.75 7.07 Promedio general de hidropaticidad (GRAVY) -0.004 0.087 Localización celular Citoplasma Forma activa Homotetrámero Superfamilia LDH/MDH Tipo de enzima Oxidoreductasa Cofactor NAD+