Sangolquí, 2 – 13 de febrero de 2004 Mecanismos de acción de agentes de biocontrol de enfermedades en postcosecha Sangolquí, 2 – 13 de febrero de 2004

Objetivos Comprender como actúan los ACB. Definir los diferentes mecanismos mediante los cuales ejercen su acción los agentes de CB. Analizar la importancia de conocer los mecanismos de acción a los efectos de potenciar la actividad biocontroladora.

Agente de biocontrol ideal Características Estabilidad genética Eficacia a bajas concentraciones Eficacia en más de un patosistema Inocuidad frente a flora no patógena Inocuidad frente a animales y plantas Requerimientos nutricionales sencillos Compatibilidad con otros métodos de control

AGENTES BIOCONTROLADORES Mecanismos de acción PATÓGENO AGENTES BIOCONTROLADORES HOSPEDERO A B B Interacción agente-patógeno Amensalismo Parasitismo Competencia por nutrientes Hipovirulencia A Interacción agente-huésped Inducción de resistencia Competencia por nutrientes

Amensalismo Definición: Producción por parte de un organismo (antagonista) de sustancias inhibitorias o tóxicas para otro tipo de organismo. En el caso del control biológico postcosecha se han descrito antagonistas productores de antibióticos y/o enzimas líticas.

Antibióticos Productos del metabolismo secundario de un microorganismo que provocan la muerte o la inhibición del crecimiento de otro. Compuestos orgánicos de bajo peso molecular Activos en bajas concentraciones (menores de 10 ppm) Detección in vitro sencilla Cultivos duales Ensayos de difusión

Antibióticos

Problemas Producción muy dependiente de las condiciones de cultivo Pueden aparecer cepas resistentes Acción frente a flora benéfica Ejemplos Agrobacterium K84 Agrocin 84 Pseudomonas fluorescens Pirrolnitrina Pseudomonas syringae Siringomicina E

Ejemplo:Biocontrol de Agalla de corona Producida por Agrobacterium tumefaciens Antagonista :Agrobacterium radiobacter Descubierto por Kerr en 1970

Agalla de corona

Biocontrol de agalla de corona Agrobacterium radiobacter K84 produce un antibótico (agrocin 84) activo contra Agrobacterium tumefaciens Esta información genética está codificada en un plásmido Agrobacterium radiobacter K84posee la información necesaria para resistir a agrocin 84

Biocontrol de agalla de corona Han aparecido cepas de Agrobacterium tumefaciens resistentes al agrocin 84 por transferencia de la información de resistencia Se ha creado por ingeniería genética la cepa Agrobacterium radiobacter K1026 a partir de la cepa K84 impidiendo la transferencia de genes de resistencia al agrocin 84 Está registrada como biopesticida por la EPA

Enzimas líticas Enzimas capaces de degradar compuestos de la pared de patógenos Pueden provocar ruptura de pared y lisis celular Enzimas involucradas: β 1-3 y β 1-6 glucanasas quitinasas proteasas

Pared fúngica Chitin

Pared fúngica Polímeros tipo gel Polímeros fibrosos Grupo taxonómico glucano (1-3)(1-6)glucano celulosa Oomycota Glucano Quitina Chytridiomycota Ác. Poliglucurónico Glucuromanoproteína Polifosfatos Quitosano Zygomycota Galactomanoproteína (1-3)glucano Ascomycota Xilomanoproteína quitina Basidiomycota Polímeros tipo gel Polímeros fibrosos Grupo taxonómico

Producción de enzimas líticas Penicillium rugulosum en cultivo dual con Monilinia fructicola

Producción de enzimas líticas Ejemplos en biocontrol postcosecha Castoria et al. (1997) Cryptococcus laurentii productor de β1,3 glucanasas Castoria et al. (2001) Aureobasidium pullulans productor de quitinasas y β1,3 glucanasas in vitro y en heridas de fruto

Micoparasitismo Utilización del hongo patógeno como alimento por el antagonista

Micoparasitismo Implica la producción de enzimas degradadoras de paredes fúngicas: β 1-3 glucanasas, quitinasas, proteasas A veces está mediado por lectinas

Micoparasitismo Ejemplos en biocontrol postcosecha: Wisniewski et al (1991) Unión de Pichia guillermondii a micelio de Botrytis cinerea Castoria et al. (1997) Unión de Rhodotorula glutinis a Botrytis cinerea

Hipovirulencia Disminución de la agresividad de un patógeno Ejemplo: Control biológico cancro del castaño producido por Cryp.... nectria Agente de biocontrol: Cepas hipovirulentas del patógeno portadoras de mycovirus Modo de control: Pasaje del mycovirus a las cepas virulentas

Competencia Comportamiento desigual de dos o más organismos frente a un mismo requerimiento, cuando la utilización del mismo por uno de los organismos, lo vuelve insuficiente para los demás. Competencia por: Espacio Oxígeno Nutrientes: Carbono, nitrógeno, hierro, etc.

Colonización del sitio de acción Ejemplo: Colonización de Aureobasidium pullulans B23 en heridas de manzana Red delicious a 1ºC

Competencia por nutrientes

Competencia por hierro

INDUCCIÓN DE RESISTENCIA Resistencia: Capacidad de un organismo sobreponerse completamente o en cierto grado a la acción de un patógeno

Interacciones planta patógeno Compatibles: Se produce enfermedad Incompatibles: La planta resiste. No hay enfermedad Resistencia Constitutiva Inducida

Interacción planta patógeno Reconocimiento Liberación de inductores Activación de sistemas de defensa inducibles

Interacciones planta patógeno En interacciones incompatibles se desencadenan los mecanismos de defensa inducibles de forma de frenar el avance del patógeno En interacciones compatibles los mecanismos de defensa no son activados o lo son tardíamente.

Mecanismos de defensa inducibles Activación: Interacciones patógeno-planta Heridas Inductores microbianos Inductores químicos

Activación de defensa Explosión oxidativa

Explosión oxidativa

Respuestas de defensa Hipersensibilidad: Respuesta de resistencia que se genera en el sitio de desafío y previene la diseminación posterior del patógeno dentro de la planta localizada síntomas limitados incapacidad del patógeno de crecer y/dispersarse muerte celular

HIPERSENSIBILIDAD Barreras estructurales Inductores Sustancias antifúngicas fitoalexinas radicales Enzimas PRP

Respuestas de defensa Ruta de fenilpropanoides Formación de lignina y suberina (barrera estructural) Formación de fitoalexinas Fitoalexinas: Compuestos no constitutivos con actividad antimicrobiana, formados como respuesta de defensa

Respuestas de defensa Producción de PRP Proteínas relacionadas con la patogénesis Tienen actividad enzimática Actúan contra el patógeno o reforzando las barreras estructurales

PRP Actividad Blanco de acción PR1 ? Membrana patógeno PR2 β 1-3 glucanasa Pared patógeno PR3-PR4 Endoquitinasa Pared patógeno PR5 ? Membrana patógeno PR6 Inhibidor de proteasa Proteasa PR7 Proteasa ? PR8 Endoquitinasa Pared patógeno PR9 Peroxidasa Formación de lignina PR10 RNasa ? Sin clasificar Inhibidor de la poligalacturonasa poligalacturonasa

Respuestas de defensa Resistencia inducida: Fenómeno por el cual una planta estimulada adecuadamente, exhibe una respuesta de resistencia aumentada ante la llegada de un patógeno (Van Loon, 1997) Proceso de resistencia activa dependiente de barreras físicas o químicas de la planta huésped activada por agentes bióticos o abióticos (Kloepper, 1992)

Resistencia Inducida Resistencia inducida: necesita mensajero sitio de acción más o menos alejado del sitio de estimulación ausencia de toxicidad del mensajero sobre el patógeno de desafío no hay relación dosis-respuesta sobrepasando determinado umbral no específico

Resistencia inducida LAR (localizated adquired resistance) Aparece en la vecindad del sitio de inducción SAR (systemic adquired resistance) Respuesta alejada del sitio de inducción Mediador químico: ácido salicílico

Resistencia inducida en postcosecha Barreras estructurales Fitoalexinas PRP (quitinasas,glucanasas,proteasas)

Resistencia inducida Inductores: Físicos: heridas, luz UV Químicos: quitosano, harpin, ácido beta amino butírico Microbianos: Paredes de patógeno,ciertos microorganismos antagonistas

Ejemplos I 24 horas después de la inoculación de heridas de manzana con Aureobasidium pullulans L47 se observó la producción de hidrolasas antifúngicas (quitinasas, glucanasas) y de peroxidasa.Se relaciona la actividad biocontroladora con la inducciónde resistencia

Ejemplos II Induction of glucanase, chitinase and phenylalanine ammonia lyase in peach fruit by UV-C treatment. El Gaouth et al. (2003) Phytopathology Se logró inducción enzimática por exposición al UV-C (7.6KJ/m2 durante 10 min). La actividad enzimática comenzó 6 horas después del tratamiento y llegó al máximo 96 horas después.

Ejemplos III Por aplicación de BABA en heridas se logró inducción de quitinasas ( luego de 48 horas) y fenilalanina amonio liasa (luego de 72 horas)

Inducción de resistencia a distancia Ejemplos IV Control of postharvest decay of apple fruit with Candida saitoana and induction of defense responses. ( El Gaouth et al. (2003) Phytopathology) Inducción de resistencia a distancia

Ejemplos IV Inoculación de antagonista y patógeno en heridas separadas Resistencia a patógeno aparece luego de 48 horas de inoculado el antagonista Se logra reducir la severidad en 50 a 70% Se detecta presencia de glucanasas en heridas vecinas a la herida inoculada

Conclusiones Los agentes de biocontrol pueden actuar por varios mecanismos de acción Se busca que el agente aplicado ejerza el biocontrol por más de un mecanismo Es posible combinar agentes que actúen por mecanismos diferentes de forma de potenciar su acción biocontroladora.