Inhibición enzimática

Inhibidor: Efector que hace disminuir la actividad enzimática, a través de interacciones con el centro activo u otros centros específicos (alostéricos). Esta definición excluye todos aquellos agentes que inactivan a la enzima a través de desnaturalización de la molécula enzimática De esta forma, habrá dos tipos de inhibidores: I. Isostéricos: ejercen su acción sobre el centro activo II. Alostéricos: ejercen su acción sobre otra parte de la molécula, causando un cambio conformacional con repercusión negativa en la actividad enzimática.

Los inhibidores isostéricos pueden ser de dos tipos: 1. Inhibidor reversible: establece un equilibrio con la enzima libre, con el complejo enzima-substrato o con ambos: E + I EI ES + I ESI 2. Inhibidor irreversible: modifica químicamente a la enzima: E + I E’

Inhibición reversible (a) El inhibidor se fija al centro activo de la enzima libre, impidiendo la fijación del substrato: Inhibición Competitiva (b) El inhibidor se fija a la enzima independientemente de que lo haga o no el substrato; el inhibidor, por tanto, no impide la fijación del substrato a la enzima, pero sí impide la acción catalítica: Inhibición No Competitiva (c) El inhibidor se fija únicamente al complejo enzima-substrato una vez formado, impidiendo la acción catalítica; este tipo se conoce como Inhibición Anticompetitiva

E ES EI I S E + P Inhibición Competitiva Las fijaciones de substrato e inhibidor son mutuamente exclusivas; el complejo EI no es productivo

E ES EI I S E + P ESI Inhibición No Competitiva El inhibidor se fija indistintamente a la enzima libre E y al complejo enzima-substrato ES; ni el complejo EI ni el complejo ESI son productivos

E ES S E + P I ESI Inhibición Anticompetitiva El inhibidor sólo puede fijarse al complejo ES; el complejo ESI no es productivo

Inhibición Competitiva S ES E + P I Se define una constante de equilibrio de disociación del inhibidor: [E] [I] Ki = [EI] EI Características: - Las fijaciones de substrato e inhibidor son mutuamente exclusivas - A muy altas concentraciones de substrato desaparece la inhibición - Por lo general, el inhibidor competitivo es un análogo químico del substrato. - El inhibidor es tan específico como el substrato

En condiciones de equilibrio rápido, llamando y a la concentración del complejo EI, para la inhibición competitiva obtenemos el siste- ma de ecuaciones De donde Que resuelto para x nos da

Por tanto, en la inhibición competitiva, 1. El efecto cinético del inhibidor es el aumento aparente de la Km, que aparece multiplicada por el factor (1 + i/Ki) 2. La Vmax no aparece modificada; para concentraciones muy altas del substrato, v = Vmax, igual que en ausencia de inhibidor 3. Cuanto más pequeño sea el valor de Ki mayor será la potencia del inhibidor competitivo.

Inhibición competitiva - Representación recíproca doble 1/Vmax -1/Km -1/(Km(1 + i/Ki))

Succinato deshidrogenasa Inhibidores competitivos Succinato deshidrogenasa

Inhibidores competitivos como ánalogos estructurales del substrato

4-aminobenzoato 4-aminobenceno sulfonamida

Ác. Fólico Methotrexate

Análogos de base Timina 5-Bromouracilo

Análogos de nucleósido Citidina Citosina arabinósido

Un paso más allá en el desarrollo de inhibidores potentes es el concepto de Análogo de Estado de Transición (AET) - El inhibidor no es estrictamente análogo del substrato, sino del Estado de Transición de la reacción. - La afinidad de las enzimas por los AET es enorme, del orden nM o pM, con lo que la fijación es tan fuerte que puede considerarse irreversible

Susbtrato Estado de transición + Productos Análogo de estado de transición

Estado de transición Substrato Análogo de estado de transición

N-fosfonoacetil L-aspartato transcarbamilasa Estado de transición Análogo de estado de transición: N-fosfonoacetil L-aspartato (PALA)

Angiotensinógeno Hipotensión, hipovolemia, ortostatismo Renina Angiotensina I DRVYIHPFHL Enzima convertidora de Angiotensina, ECA HL Angiotensina II DRVYIHPF Aumento de la presión arterial

+ + Zn2+ Zn2+ Análogos de Estado de Transición: Captopril de la ECA Captopril

Inhibición Irreversible - Los inhibidores irreversibles reaccionan con un grupo químico de la enzima, modificándola covalentemente - Su acción no se describe por una constante de equilibrio Ki, sino por una constante de velocidad ki: E + I E’ - A diferencia de la inhibición reversible, el efecto de los inhibidores irreversibles depende del tiempo de actuación del inhibidor. - Los inhibidores irreversibles son, por lo general, altamente tóxicos.

Algunos tipos de inhibidores irreversibles 1. Reactivos de grupos -SH 2. Organofosfóricos 3. Ligandos de metales 4. Metales pesados

Reactivos de grupos -SH, 1 (a) Agentes alquilantes Yodoacetato (b) Compuestos insaturados N-Etil maleimida (NEM)

Reactivos de grupos -SH, 2 (c) Formadores de mercáptidos p-Hidroximercuribenzoato (d) Oxidantes Promueven la oxidación de dos tioles a un disulfuro

Organofosfóricos DFP: diisopropil - Actúan sobre enzimas serínicas fluorofosfato - Actúan sobre enzimas serínicas - Únicamente sobre la Ser activa - Insecticidas: Parathion, Malathion - Inhibidores de la Acetilcolinesterasa - Neurogases

Ligandos de coordinación de metales Es el caso del ion cianuro, CN- Se fija con gran afinidad a la sexta posición de coordinación del Fe hemínico, impidiendo toda modificación posterior. Por ello actúa sobre sistemas de Fe hemínico con la sexta posición de coordinación libre, como la citocromo oxidasa, de lo que deriva su elevadísima toxicidad

Substratos suicidas (Inhibidores activados enzimáticamente) - Se trata de moléculas que se unen al centro activo de manera específica, igual que el substrato o los inhibidores competitivos - Una vez unidos al centro activo, la enzima transforma la molécula en una especie química muy reactiva que modifica covalentemente a la enzima, inactivándola - Tienen por tanto (a) la especificidad del inhibidor competitivo y (b) la potencia de los inhibidores irreversibles

E + I EI EI* E’ + I* Modo de acción de los inhibidores suicidas 1 2 3 1. El inhibidor se fija a la enzima igual que el substrato o un inhibidor competitivo convencional 2. La acción catalítica de la enzima convierte al inhibidor I en una especie altamente reactiva I* 3. I* modifica covalentemente a la enzima, inactivándola de forma definitiva al igual que un inhibidor irreversible.

Ejemplos de inhibidores suicidas, 1 - Sistema de la b-lactamasa bacteriana La utilización masiva de antibióticos b-lactámicos (penicilinas, sus derivados semisintéticos y cefalosporinas) ha conducido a la aparición de resistencias a los mismos. Los microorganismos resistentes a estos antibióticos lo son por producir una enzima, la b-lactamasa, que inactiva a los antibió- ticos b-lactámicos.

Penicilina (activa) b-Lactamasa Ác.peniciloico (inactivo)

Muy a menudo los preparados de penicilinas o penicilinas semisintéticas se formulan añadiendo un inhibidor suicida de la b-lactamasa, el ácido clavulánico b-Lactamasa Ác.clavulánico Esta molécula reacciona con la serina activa de la b-lactamasa, produciendo su inactivación

Ejemplos de inhibidores suicidas, 2 - Sistema de la monoamino oxidasa (MAO) cerebral Los estados depresivos, en general, están relacionados con un descenso en la concentración de neurotransmisores adrenérgicos (dopamina, noradrenalina, etc.) en determinadas regiones del cerebro. Una de las enzimas encargadas de la degradación de estos neurotransmisores es la monoamino oxidasa (EC 1.4.3.4). Por tanto, la inhibición de la monoamino oxidasa se emplea como terapéutica de los estados depresivos. Se han desarrollado muchos inhibidores suicidas de la MAO

Noradrenalina Monoamino oxidasa La MAO es una flavoproteína: tiene un grupo prostético flavínico (FAD) fundamental para la catálisis. Los inhibidores suicidas de la MAO inactivan al cofactor FAD. Dihidroxifenilglicol

N,N’ dimetil propargilamina (pargilina) Flavina Inhibición suicida de la MAO mediante Pargilina Flavina modificada