PROGRAMA ANALITICO Y/O DE EXAMEN LIC. CS. BIOLÓGICAS – PROF. BIOLOGÍA – LIC. BIOTECNOLOGÍA QCA. BIOLÓGICA PROGRAMA ANALITICO Y/O DE EXAMEN   BOLILLA 2: Transporte electrónico mitocondrial. Fosforilación oxidativa. Mitocondrias. Cadena respiratoria. Localización. Balance energético. Desacoplantes: proteínas desacopladoras. Inhibidores. Síntesis de ATP. Hipótesis quimiosmótica. Translocasas. Regulación de la fosforilación oxidativa. Oxidasa alternativa en vegetales. Transporte electrónico cloroplástico. Fotofosforilación y fotosíntesis. Proceso en plantas superiores. Reacciones luminosas. Captación de la energía luminosa. Cloroplastos y pigmentos. Transporte electrónico cíclico y no cíclico. Síntesis de ATP por fotofosforilación. Similitudes entre fosforilación oxidativa y fotofosforilación. Concepto unificador de la teoría quimiosmótica. Otros organismos fotosintetizadores. Sistema microsomal de transporte electrónico. Formación de compuestos oxígeno-reactivo. Radicales libres. Sistemas de protección.

Representación esquemática de una oxidación biológica Repasemos de la clase anterior Representación esquemática de una oxidación biológica A (OX) BH2 (RED) Sustrato H2 C (OX) H2O AH2 (RED) B (OX) CH2 (RED) Sox ½ O2 Energía E E E Escala de Potencial de Reducción E´o (-) E´o (+) O2 S ½ O2 + 2 H+ + 2 e- → H2O + 0.82 V

Si se conocen los potenciales de reducción de dos pares redox, Repasemos de la clase anterior Si se conocen los potenciales de reducción de dos pares redox, se puede predecir que en condiciones estándar, el sistema con potencial más elevado tenderá a ganar electrones y sufrir reducción mientras que el otro se oxidará. Los electrones van siempre desde el par redox de menor a aquel de mayor Potencial de Reducción. Las diferencias de potencial de reducción (DEo) entre dos pares redox crean diferencias de potencial electromotriz, a favor de la cual se produce un flujo de electrones. Este flujo de electrones determina la liberación de Energía utilizable (DG) El cambio de Energía Libre estándar (DGo) puede calcularse DEo y DGo están relacionados DGo = -n.F. DEo n: número de elelectrones transferidos F: constante (Faraday 23,062 kcal) DEo : se expresa en voltios

CADENA DE TRANSPORTE ELECTRÓNICO Repasemos de la clase anterior CADENA DE TRANSPORTE ELECTRÓNICO Cadena Respiratoria o Cadena de Transporte Electrónico: Grupos de moléculas aceptores de hidrógeno y/o e- dispuestos en la membrana mitocondrial interna. (H y e- : “Equivalentes de Reducción”). Los componentes actúan secuencialmente en orden creciente de sus potenciales de reducción. Reciben equivalentes de reducción de NADH Y FADH2 producidos en la matriz. La energía que se libera durante la transferencia electrónica está acoplada a varios procesos endergónicos entre los que se destaca la síntesis de ATP.

TRANSPORTADORES DE ELECTRONES En la mayoría de las reacciones de oxidación celular, los electrones son transportados por moléculas que se reducen en los procesos catabólicos Permitiendo así la conservación de la energía liberada por la oxidación de los sustratos.

ENZIMAS DESHIDROGENASAS Gran parte de los sustratos oxidados en el organismo sufren deshidrogenación. Las reacciones de deshidrogenación son catalizadas por las ENZIMAS DESHIDROGENASAS En estas reacciones el hidrógeno es captado por una coenzima. Las coenzimas pueden ser: - Nicotinamida (NAD o NADP) - Flavina (FAD o FMN).

NIACINA O VITAMINA B3 RIBOFLAVINA O VITAMINA B2 │ │H Nicotinamida + NAD (NADP) FAD (FMN) Intervienen como cofactor enzimático en el metabolismo energético de macronutrientes

OXIDORREDUCTASAS (DESHIDROGENASAS) Deshidrogenasas ligadas a NAD ó nicotinamídicas AH2 + NAD+ A + NADH + H+

REACCION DE REDUCCION DE NAD+ .. H H + H+ │ R R │ │H + :H- (ion hidruro) Anillo de nicotinamida NAD OXIDADO NAD REDUCIDO

¿Qué reacciones proveen de NADH a la Cadena Respiratoria? Deshidrogenasas NAD dependientes Piruvato deshidrogenasa Isocitrato deshidrogenasa Malato deshidrogenasa a-cetoglutarato deshidrogenasa CICLO DE KREBS Sustrato + NAD+ Producto + NADH + H Deshidrogenasas NAD dependientes Cadena Respiratoria

Deshidrogenasas ligadas a FAD ó a FMN AH2 + FAD (FMN) A + FADH2 +(FMNH2) El FAD tiene además un nucleótido de adenina unido al fosfato P-Ribosa-Adenina

FLAVINA R . H + - Anillo isoaloxacina R e- + H+ e- + H+ R H

COMPONENTES DE LA CADENA DE TRANSPORTE ELECTRONICO FLAVOPROTEINAS: FMN o FAD: Transportan 2 e- y 2 H+ PROTEINAS FERROSULFURADAS: Transportan e- (Fe+++ Fe++) COENZIMA Q o UBIQUINONA: Quinona isoprenoide no proteica. Transporta 1 e- y libera 2 H+. CITOCROMOS b, c, c1, a, a3: Proteínas que contienen un grupo hemo. Transportan 1 e-

Es la Coenzima Q, una Benzoquinona liposoluble Posse una cadena lateral isoprenoide (R) Molécula pequeña que difunde a través de las membranas.

Estructura de los citocromos Hemo A (Citocromo a y a3) Estructura general de citocromo c y c1 Son proteínas con un grupo prostético hemo unido a Fe. Las mitocondrias poseen 3 tipos de Citocromos: a, b y c

Componentes de la Cadena de transporte electrónico Complejo enzimático Grupos prostéticos Complejo I (NADH deshidrogenasa) FMN, FeS Complejo II(succinato deshidrogenasa) FAD,FeS Complejo III (citocromo bc1) Hemo, FeS Citocromo c Hemo Complejo IV (citocromo oxidasa) Hemo, Cu

Ordenamiento de los componentes de la Cadena Respiratoria Complejos

H2O Fumarato FAD e- Succinato NADH e- II Fe-S e- NAD+ FMN I III Cit.c Complejo II SUCCINATO DESHIDROGENASA FAD Fe-S II e- NADH FMN Fe-S I NAD+ e- Succinato e- Fe-S Fe III Coenzima Q Fe Cit.c Complejo I NADH UBIQUINONA REDUCTASA Cit.b /Centro Fe-S/ Cit c1 Fe/Cu O2 IV Complejo III CITOCROMO C –COENZIMA Q OXIDO REDUCTASA Cit.a Cit a3 Complejo IV CITOCROMO OXIDASA H2O

Cadena de Transporte de Electrones Feduchi, Blasco, Romero, Yañez. Bioquímica. 1° Edición

REACCIONES DEL COMPLEJO I NADH + H+ NAD+ + 2 e- + H+ (Eo= - 0,32 V) FMN + 2 e- + 2 H+ FMNH2 (Eo= - 0,22 V) NADH + H+ + FMN → FMNH2 + NAD+

Camino de los equivalentes de reducción en el Complejo I

COMPLEJO II Succinato-coenzima Q oxidorreductasa (E) Coenzima: FAD Proteínas ferrosulfuradas Transfiere equivalentes de reducción desde succinato a la coenzima Q Succinato + E-FAD Fumarato + E-FADH2 E-FADH2 + Prot-Fe+++ E-FAD + Prot-Fe++ Prot-Fe++ + CoQ Prot-Fe+++ + CoQH2

CAMINO DE LOS ELECTRONES desde el COMPLEJO III al O2 ½ O2 + H+ CoQH2 Fe+++ Fe++ Fe+++ Fe++ Fe+++ Fe++ Cit. b566 Cit. b562 Cit. c1 Cit. c Cit. a.a3 Fe-S CoQ H2O Fe++ Fe+++ Fe++ Fe+++ Fe++ Fe+++ Complejo III Complejo IV

Ciclo “Q” : Paso de electrones y protones a través del Complejo III Extraído de Lehninger, A.L., Nelson, D., Cox M. “Principios de Bioquímica”, 2006

Paso de los electrones por el Complejo IV Bombeo de H+ acoplado Extraído de Lehninger, A.L., Nelson, D., Cox M. “Principios de Bioquímica”, 2006

LA CADENA DE TRANSPORTE DE ELECTRONES comprende dos procesos: 1.- Los electrones son transportados a lo largo de la membrana, de un complejo de proteínas transportadoras a otro. 2. Los protones son translocados a través de la membrana, desde el interior o matriz hacia el espacio intermembrana de la mitocondria. Esto determina la formación de un gradiente de protones. El oxígeno es el aceptor terminal del electrón, combinándose con electrones e iones H+ para producir agua.

La transferencia de electrones desde el NADH a través de la cadena respiratoria hasta el O2 es un proceso altamente exergónico. La mayor parte de esa energía se emplea para bombear protones fuera de la matriz. Por cada par de electrones transferidos al O2  los complejos I y III bombean 4 H+ y 2 el complejo IV. El complejo II no transfiere H+ ya que no atraviesa la membrana interna como los demás. Así esta energía electroquímica generada por el gradiente protónico impulsa la síntesis de ATP.

Oxidaciones en la Mitocondria: Aportes de NADH+H+ y FADH2

Transporte Electrónico mitocondrial ¿Qué tipo de proceso? El flujo de e- ocurre a favor del gradiente de Potencial de Reducción Es un proceso exergónico Transcurre con disminución de energía libre Neto posee un – DG Desde NADH+H hasta O2 y formar H2O : - 52,6 Kcal/mol ¿Se puede aprovechar esa Energía en otro proceso? ¿En formación de enlaces fosfato de alta energía?

Adenosina Trifosfato (ATP) Moléculas de alta energía Adenosina Trifosfato (ATP)

Energía de Hidrólisis de los Compuestos de elevada Energía Hidrólisis con eliminación de la repulsión de cargas Ionización Estabilización por resonancia Hidrólisis del ATP (- 7,3 Kcal/mol)

FOSFORILACIÓN OXIDATIVA (DG°´ + 7,3 Kcal/mol) ADP + Pi ATP + H2O (DG°´ - 7,3 Kcal/mol) La producción de ATP utilizando Energía liberada durante el Transporte de Electrones en la Cadena Respiratoria mitocondrial se denomina FOSFORILACIÓN OXIDATIVA

¿Dónde ocurre la síntesis de ATP? COMPLEJO ATP sintasa F1 : 9 subunidades polipeptídicas: a3 b3 g d e y 3 sitios catalíticos Fo: Proteína integral , canal transmembrana para protones con 3 subunidades: a, b2 y c12 Esta enzima es la que transforma la energía cinética (fuerza protón-motriz) en la energía química del ATP. El Dr. Boyer (1964) recibió el Premio Nobel al describir la ATP sintasa.

¿Cómo ocurre la síntesis de ATP ¿Cómo ocurre la síntesis de ATP? FOSFORILACIÓN OXIDATIVA La Cadena de Transporte de Electrones y la FOSFORILACIÓN OXIDATIVA estuvieron separadas conceptualmente por mucho tiempo. En 1961 Peter Mitchell propuso la Hipótesis Quimiosmótica “LA FORMACIÓN DEL ATP (O FOSFORILACIÓN DEL ADP), ES POSIBLE POR LA DIFERENCIA EN LA CONCENTRACIÓN DE PROTONES A TRAVÉS DE LA MEMBRANA”

PETER DENNIS MITCHELL (1920 - 1992) Hipótesis Quimiosmótica -A partir de 1961 trabajó en el estudio sobre el almacenamiento de la energía en los seres vivos para ser posteriormente transportada a los puntos de utilización por medio de las moléculas de ATP. -La energía liberada por el traslado de electrones en la cadena respiratoria se conserva mediante la fosforilación del ADP, que se convierte nuevamente en ATP, proceso denominado FOSFORILACIÓN OXIDATIVA. -En 1978 fue galardonado con el Premio Nobel de Química por sus trabajos sobre el INTERCAMBIO DE ENERGÍA BIOLÓGICA MEDIANTE LA TEORÍA DE LA QUÍMICA OSMÓTICA.

ESPACIO INTERMEMBRANA SINTESIS DE ATP TEORIA QUIMIOSMOTICA Traslocación de H+ acoplada al Transporte de electrones H+ MATRIZ ESPACIO INTERMEMBRANA H+ H+ e- e- e- e- H+ H+ H+ H+ H+ H+ 3 ATP

H+ H+ H+ e- e- e- 2 ATP H+ H+ H+

POSTULADOS DE LA TEORIA QUIMIOSMOTICA Membrana mitocondrial impermeable a protones. Traslocación de H+ durante el transporte de electrones. Formación de un gradiente electroquímico (H+ y cargas positivas). Los protones acumulados en el espacio intermembrana crean una fuerza: «protón-motriz», por la tendencia de volver a pasar al interior para igualar el pH a ambos lados de la membrana. El pasaje de los H+ a través de Fo activan la ATP sintasa.

Translocasa ADP-ATP y Transportador de Pi La energía del gradiente de protones se utiliza también para el transporte

Relación P/O en Cadena de Transporte Electrónico Experimento: Mitocondrias + Sustrato oxidable Consumo de Pi y O2 Sustrato oxidable + Deshidrogenasa NAD dep. NADH+H+ Sustrato oxidable + Deshidrogenasa FAD dep. FADH2 e- e- e- e- P/O = 2 /1 (1,5/1) P/O = 3/1 (2,5/1) P/O: Relación entre moléculas de P y átomos de O2 consumidos

Control respiratorio por el aceptor El control de la fosforilación oxidativa permite a la célula producir solo la cantidad de ATP que se requiere para el mantenimiento de sus actividades. El cociente máximo medido para la oxidación de NADH es 2,5 y para FADH2 es 1,5, para mayor practicidad se consideran 3 ATP y 2 ATP, respectivamente. Control respiratorio por el aceptor Las mitocondrias solo pueden oxidar al NADH y al FADH cuando hay una concentración suficiente de ADP y Pi. Cuando todo el ADP se transformó en ATP, disminuye el consumo de oxígeno y aumenta cuando se suministra ADP.

INHIBIDORES Inhibidores del transporte electrónico Inhiben solamente el transporte de e- Inhibidores de la fosforilación Inhiben la síntesis de ATP , indirectamente el transporte de e- Desacoplantes Impiden la síntesis de ATP pero no inhiben el transporte de electrones Inhibidores de la translocasa Inhiben la entrada de ADP y la salida de ATP desde la mitocondria

INHIBIDORES del TRANSPORTE ELECTRÓNICO Complejo III Complejo I Complejo IV El uso de inhibidores no solo ha ayudado a deducir la secuencia de la cadena respiratoria, sino que ha permitido conocer mejor el mecanismo de acción de algunos fármacos y venenos.

Inhibidores del Transporte Electrónico Compuesto Comentario Modo de Acción Rotenona Amital Insecticida Barbitúrico: induce el sueño Impiden la transferencia electrónica desde Fe-S a la CoQ Antimicina A Antibiótico Bloquea la transferencia electrónica desde cit. B a cit. c1 Cianuro Monóxido de carbono Inhiben la citocromo oxidasa

Inhibidores de la Fosforilación Compuesto Comentario Modo de acción Oligomicina Antibiótico Bloquea el flujo de protones a través de F0 .

INHIBIDORES DE LA FOSFORILACIÓN Oligomicina: Bloquea el flujo de protones a través de Fo. Se inhibe la síntesis de ATP Se acumulan protones y se produce una fuerza inversa deteniéndose el transporte de electrones.

DESACOPLANTES Actúan como ionóforos eliminando el gradiente de protones. Desacoplan la fosforilación del transporte electrónico O- 2,4 Dinitrofenol (DNP) + H+ Forma protonada que atraviesa la membrana

DESACOPLANTES Compuestos que impiden la síntesis de ATP, pero no bloquean el flujo de electrones, de esa manera desacoplan la cadena respiratoria de la fosforilación oxidativa. El 2,4-dinitrofenol (DNF) transfiere iones hidrógeno desde el lado externo hacia la matriz y anula el gradiente de protones creado por la cadena respiratoria. Termogenina de la “grasa parda”

Problema 7) La “grasa parda” es un tipo de tejido adiposo que poseen los animales que hibernan y los niños, y que también está presente (aunque en baja proporción) en seres humanos adultos. Este tejido posee un alto contenido en mitocondrias (dándole una apariencia marrón), las cuales tienen una relación P/O menor que 1. a) ¿Qué papel fisiológico desempeñan las mitocondrias de este tejido? b) ¿Qué diferencias hay entre las mitocondrias de este tejido y las de otros tejidos?

Proteína TERMOGENINA: por mitocondrias desacopladas Generación de calor por mitocondrias desacopladas Extraído de Lehninger, A.L., Nelson, D., Cox M. “Principios de Bioquímica”, 2006

Oxidaciones mitocondriales alternativas en plantas Extraído de Lehninger, A.L., Nelson, D., Cox M. “Principios de Bioquímica”, 2006

Espata Espadice

Cadena de transporte electrónica alternativa en plantas - Papel fisiológico Producción de calor en algunas especies vegetales como por ej. Araceae species en un etapa anterior a la polinización para producción de compuestos aromáticos que atraen a los polinizadores. Es activa durante períodos de altas velocidades de oxidación de sustratos para evitar la producción de radicales libres.(Esqueletos carbonados C.Krebs) Es activa en situaciones de estrés (sequia, temperaturas extremas, tóxicos presentes en el suelo, falta de Pi, patógenos)( en estas situaciones disminuye la velocidad de la cadena respiratoria normal)

BIBLIOGRAFÍA “Química Biológica”-Lehninger A. L., Cap. 19, 4ª Edic. (2007) “Bioquímica” - Mathews Ch., Van Holde K.E., Ahern K. Cap 17: 665 – 699, 3ra Edic., Pearson Educ. S.A. (2002) “Fisiología Vegetal” – Taiz L., Zeiger E., Vol I , Cap 7, 3ra Edic., (2006)