Susana Gil2, Suyén Rodríguez2 and Alberto del Monte1 Covalent immobilization of Pleurotus ostreatus laccase on Glyoxyl-Sepharose CL 4B support trough RDID strategy Bessy V. Cutiño Avila1 Susana Gil2, Suyén Rodríguez2 and Alberto del Monte1 1Grupo de Tecnología Enzimática, Centro de Estudio de Proteínas, Facultad de Biología, Universidad de La Habana, La Habana, Cuba. Email: adelmonte@fbio.uh.cu 2Centro de Estudios en Biotecnología Industrial, Facultad de Ciencias Naturales, Universidad de Oriente, Santiago de Cuba, Cuba.

ABSTRACT Enzymes are usually stable when stored at low temperatures and neutral pHs in aqueous media. The application of immobilization processes allows that enzymes can be recovered from solution and reused. Moreover, the enzyme stability can usually be enhanced as well as the ability to run a process on a continuous basis. The genus Pleurotus comprises a group of edible ligninolytic mushroom with medicinal properties and important biotechnological and environmental applications. Laccase have great potential in industrial applications and are capable of degrading a wide range of xenobiotics. In the present study the enzyme laccase from Pleurotus ostreatus (POLac) was covalently immobilized in Glyoxyl-Sepharose CL 4B support. To define the optimal immobilization parameters was applied the Rational Design of Immobilized Derivatives, implemented into RDID1.0 program, in which new mathematical algorithms and bioinformatics tools are harmonically combined for designing an optimal immobilization process (del Monte-Martínez and Cutiño-Avila, 2012). The detailed objectives of the study were to: i) predict the best support material for laccase immobilization; ii) immobilize POLac according to the predicted parameters from RDID1.0 program. The accuracy of RDID predictions were evaluated with the obtained experimental results.

Lacasas Las lacasas (benzenodiol: oxígeno oxidoreductasas, EC 1.10.3.2) son glicoproteínas extracelulares que contienen usualmente cuatro átomos de cobre (Fig. 1), aunque están informadas en la literatura estructuras con dos, tres y seis átomos de este elemento. Pueden encontrase en forma de estructuras monoméricas, diméricas o tretaméricas. Presentan pesos moleculares entre 60 y 390 kDa. El punto isoeléctrico (pI) informado en la literatura varía entre 2,6 y 4,5. El contenido de carbohidratos en estas enzimas está establecido en la literatura en porcentajes comprendidos entre 15 y el 20 % (Wesenberg y cols., 2003; Shleev y cols., 2004; Majeau y cols., 2010).

Tratamientos biológicos de efluentes de la Industria Textil El tratamiento de residuales empleando hongos y bacterias ofrecen las siguientes ventajas: Son más baratos No dañan el medio ambiente Producen pocas cantidades de lodos Complejo Multienzimático: Lacasa Manganeso Peroxidasa Lignina Peroxidasa Remoción de colorantes en los residuales textiles Hongos basidiomicetos de la podredumbre blanca

Diseño Racional de Derivados Inmovilizados (RDID)

Glyoxyl-Sepharose CL 4B El objetivo del presente trabajo fue optimizar la inmovilización covalente de la enzima lacasa de Pleurotus ostrestus en los soportes: Glyoxyl-Sepharose CL 4B MANA-Sepharose CL 4B Sepabeads EC-EP3 Empleando el programa RDID1.0 como implementación de la estrategia de Diseño Racional de Derivados Inmovilizados (RDID)

Predicción de la configuración más probable en el derivado inmovilizado de lacasa y el pH de inmovilización óptimo Derivado Inmovilizado No. Residuos por Clúster cCP DA %CC %CCP Supp.CC Lac-Glyoxyl pH 9,0 1 Nterm-K74-K227 0,73 9 90,01 65,80 71,5 % 2 K74-K412 0,07 17 81,13 5,70 3 K93-K527 0,20 180 0,00 Lac-MANA pH 5,0 D76-D135-D162-E341-D355-E407-E409-D451-D501 0,21 100 20,58 28,8 % D355-D365-E370-E407-E409-D466-D501 0,16 113 D365-E370-D466-D524-D526-Cterm 0,14 4 E36-D37-D57-D88-D125-D513-D514-D524-D526 93 5 D162-D172-E224-D267-E341-D450 38 57,82 8,03 6 E36-D37-D57-D88-D288-E319-D320-D321 89 1,21 0,19 Lac-Epoxy Nterm-Y32-K74-K227-Y229 0,59 19 78,91 46,84 53,1 % 0,05 4,23 K412-Y447 0,18 80 11,2 2,05 K93-Y210-K527 0,17

Configuraciones más probables de POLac inmovilizada en Glyoxyl-Sepharose CL 4B

Configuraciones más probables de POLac inmovilizada en MANA-Sepharose CL 4B

Configuraciones más probables de POLac inmovilizada en soportes activados con grupos epóxido Sepabeads EC-EP3 y Eupergit C

Optimización de la carga de proteína a inmovilizar en Glyoxyl-Sepharose CL 4B Para la optimización de la carga de proteína a inmovilizar se calcularon los parámetros mMQ, tMQ, EOC y eMQ. DM (Å) mMQ (µmol·mL-1) tMQ (mg·mL-1) OEC eMQ (mg·mL-1) 65,6 1,16 72,89 0.28 20,44 La lacasa de Pleurotus ostreatus no es un proteína pequeña La relación óptima MD/PD (1/20) no se cumple El sistema estará restringido difusionalmente (OEC < 0,45) Explica las diferencias entre la tMQ y la eMQ

Inmovilización de la enzima lacasa de Pleurotus ostreatus en Glyoxyl-Sepharose Cl 4B Una vez llevada a cabo la inmovilización se compararon los resultados con las predicciones de la optimización in silico de la inmovilización de esta enzima en los dos soportes ensayados. Derivado Inmovilizado pMQ (mg·mL-1) I% ALacInicial (U·mL-1) ALacInmov. Act. Expresada Supp.CC Lacasa-Glyoxyl Sepharose CL 4B 0,08 88% 0,18 0,11 61,1 % 71,5 % Con los resultados experimentales se corroboró que el soporte MANA-Sepharose CL 4B es el ideal para la inmovilización de la enzima lacasa de Trametes maxima con un porcentaje de actividad expresada del 61,1 %.