Modulación de la actividad transcripcional de receptores de corticoesteroides por derivados de progesterona LVI Congreso de la Sociedad Argentina de Investigación Clínica Autores. Molinari A. ; Machado-Rada M. ; Ghini A. ; Erlejman A. ; Galigniana M. Laboratorio de Biología Celular y Molecular - Dir. Dr. Mario D. Galigniana Dto. de Qca. Biológica, F.C.E.yN., U.B. A. – I.B.yM.E.

Receptores esteroidales INTRODUCCIÓN Receptores esteroidales * Factores de transcripción activables por ligando * Pertenecen a la superfamilia de receptores nucleares 3 grandes dominios funcionales 1. NTD 2. DBD (HRE) 3. LBD NTD DBD LBD 984 777 94 % homología 15 % 57 % Receptor de mineralocorticoides (MR) Receptor de glucocorticoides (GR) Estructura General N-terminal C-terminal Gran homología estructural

REMODELADORES DE LA CROMATINA INTRODUCCIÓN Receptores esteroidales UNIÓN AL DNA y ACTIVACIÓN TRANSCRIPCIONAL COACTIVADORES REMODELADORES DE LA CROMATINA CBP/P300 – SWI/SNF R R COACTIVADORES + R TRANSCRIPCIÓN HRE Genes blanco NÚCLEO

Pleiotrópicos y antagónicos según el tejido INTRODUCCIÓN Hormonas esteroideas PRINCIPALES EFECTOS BIOLÓGICOS Efectos Biológicos Mineralocorticoides Efectos selectivos * Regulación del equilibrio hidroelectrolítico (Generación hipertensión arterial ) Glucocorticoides Pleiotrópicos y antagónicos según el tejido

aNTECEDENTES Conformación más planar INTRODUCCIÓN aNTECEDENTES * El efecto gluco y mineralo de derivados de progesterona relacionado con estructura conformacional (Galigniana and Piwien Pilipuk, 2004; Galigniana et al., 2004) Conformación más planar Adquiere mayor potencia como mineralocorticoide Torsión anillo A hacia cara a (inferior) Adquiere mayor potencia como glucorticoide Torsión entre el C3=O del anillo A y el plano medio del anillo D del esteroide

Na+ en orina (inyectados/ADX) INTRODUCCIÓN aNTECEDENTES * Dada su planaridad el derivado síntetico 11,19- óxidoprogesterona (11-op), presenta mayor efecto mineralocorticoide que su esteroisómero b (6,19-op) (G. Piwien Pilipuk , 2002) * Gran similitud estructural con el derivado natural de progesterona 5α-dihidroprogesterona (5α-dhp). Na+ en orina (inyectados/ADX) Log dosis (µg/100 g) ▲5a-dhp 0 11-op • aldo

Se propone a 5a- dhp como responsable por modulación del receptor MR INTRODUCCIÓN aNTECEDENTES * 5a-dhp es muy abundante durante el embarazo (inducción 5a reductasa) Renina Angiotensina II (ATII) Aldosterona Actividad renina plasmática * En embarazo aumentan Síntesis PGI2 Resistencia periférica Efectos estradiol y progesterona * Embarazada normal NO presenta hipertensión Respuesta vascular de PGI2 ante la acción ATII relacionada con la progesterona (Gant et al., 1980) progesterona NO impide efectos de ATII, en mujeres con Hipertensión arterial gestacional Se propone a 5a- dhp como responsable por modulación del receptor MR

5a-dhp activa por sí mismo a MR – No tiene grandes efectos sobre GR RESULTADOS RESULTADOS Sección I ACTIVIDAD TRANSCRIPCIONAL ACTIVIDAD INDUCIDA POR 5a-dhp 5a-dhp activa por sí mismo a MR – No tiene grandes efectos sobre GR

ACTIVIDAD TRANSCRIPCIONAL RESULTADOS Sección I RESULTADOS ACTIVIDAD TRANSCRIPCIONAL ACTIVIDAD MR INDUCIDA POR AGONISTA EN PRESENCIA DE 5a-dhp 5a-dhp inhibió significativamente la actividad transcripcional de MR inducida por aldo

5a-dhp inhibió actividad GR RESULTADOS Sección I RESULTADOS ACTIVIDAD TRANSCRIPCIONAL ACTIVIDAD GR INDUCIDA POR AGONISTA EN PRESENCIA DE 5a-dhp 5a-dhp inhibió actividad GR

La inhibición sería de carácter NO competitivo RESULTADOS Sección I RESULTADOS Estudio del efecto inhibitorio ENSAYOS DE COMPENTENCIA La inhibición sería de carácter NO competitivo

5a-dhp NO desplazó dexa del LBD de GR RESULTADOS Sección I RESULTADOS ESTUDIO DEL EFECTO INHIBITORIO ENSAYOS DE DESPLAZAMIENTO 5a-dhp desplazó a aldo del LBD de MR - Su afinidad por el sitio de unión es menor 5a-dhp NO desplazó dexa del LBD de GR

ESTUDIO DEL EFECTO INHIBITORIO RESULTADOS RESULTADOS Sección I ESTUDIO DEL EFECTO INHIBITORIO Los receptores no translocan completamente al núcleo un presencia de 5a-dhp ESTUDIO DE LA TRANSLOCACIÓN NUCLEAR control agonista 5a-dhp agonista + 5a-dhp MR-GFP GR-GFP

En presencia de 5a-dhp, hay una perdida del efecto potenciador de p300 RESULTADOS RESULTADOS Sección I ESTUDIO DEL EFECTO INHIBITORIO INTERACCIÓN CON COACTIVADORES En presencia de 5a-dhp, hay una perdida del efecto potenciador de p300

5a-DIHIDROPROGESTERONA CONCLUSIONES CONCLUSIONES Sección I 5a-DIHIDROPROGESTERONA Dado que las concentraciones de 5a-dhp son las más elevadas durante el embarazo y que puede modular negativamente a MR, postulamos que podría tener un rol central en la regulación de la presión arterial durante el embarazo

5a-DIHIDROPROGESTERONA DISCUSIÓN Sección I 5a-DIHIDROPROGESTERONA Sus efectos antagónicos con 11-op podrían deberse a la flexibilidad diferencial de sus anillos A y B que afectaría la conformación del receptor. Las simulaciones de trayectoria en diagramas ternarios se basaron en Austin Model 1 y Becke Three Parameters Hybryd Functionals (B3LYP), y se utilizaron los programas ArgusLab 4.1. Gaussian03 y DL-Poly 2.2 para una temperatura de 310°K.

5a-DIHIDROPROGESTERONA CONCLUSIONES CONCLUSIONES Sección I 5a-DIHIDROPROGESTERONA Análisis de flexibilidad para los anillos esteroidales A B y C 5a-dhp 11-op Bote Silla Semisilla Semisilla

g2 g1 g1 – g2 Esteroides de síntesis Estructura base progesterona RESULTADOS RESULTADOS Sección II Esteroides de síntesis g1 – g2 INHIBIDORES SINTÉTICOS DERIVADOS DE PROGESTERONA g2 g1 Estructura base progesterona

Esteroides de síntesis g1 – g2 RESULTADOS Sección II RESULTADOS Esteroides de síntesis g1 – g2 EFECTOS SOBRE LA ACTIVIDAD DE MR g1 inhibe la actividad de MR de manera concentración dependiente g2 puede sinergizar con aldo aumentando la actividad de MR

ESPECIFICIDAD ANTI MINERALOCORTICOIDE RESULTADOS Sección II RESULTADOS ESPECIFICIDAD ANTI MINERALOCORTICOIDE EFECTOS CRUZADOS CON GR g1 disminuye en un 33% la actividad de GR g2 inhibe la actividad transcripcional de GR

ESTUDIOS DEL EFECTO INHIBITORIO RESULTADOS Sección II RESULTADOS ESTUDIOS DEL EFECTO INHIBITORIO ENSAYOS DE DESPLAZAMIENTO g1 desplaza a aldo del LDB de MR - Su afinidad por el sitio de unión es menor g2 desplaza a dexa del LDB de GR - Su afinidad por el sitio de unión es menor

g2 NO inhibe la reabsorción de Na+ inducida por aldo RESULTADOS Sección II RESULTADOS ESTUDIOS IN VIVO g1 – g2 ENSAYO DE RETENCIÓN DE Na+ - TEST DE KAGAWA g1 revierte reabsorción de Na+ inducida por aldo g1 inhibe la reabsorción de Na+ inducida por aldo g2 NO inhibe la reabsorción de Na+ inducida por aldo Ambos resultados son consistentes con los obtenidos en los ensayos in vitro

DISCUSIÓN Sección II g1 g1 podría utilizarse como un inhibidor de la actividad de MR dado que a bajas concentraciones, la inhibición experimentada por los otros receptores es relativamente inferior a la observada para MR g2 g2 podría utilizarse como un inhibidor de la actividad de GR dado que no modifica la actividad de AR y los efectos de sinergia con aldo se producen a partir de 1x10-8 M , donde ya se aprecia una disminución del 50% de la actividad GR

AGRADECIMIENTOS MUCHAS GRACIAS por su atención !!!

Caracterización DE LA INHIBICIÓN RESULTADOS Sección II RESULTADOS Caracterización DE LA INHIBICIÓN MR transloca parcialmente al núcleo en presencia de g1 ESTUDIO DE LA TRANSLOCACIÓN NUCLEAR - MR g1 Aldo + g1 Control Aldosterona MR transloca completamente al núcleo, en presencia de g2 Aldo + g2 g2

ESPECIFICIDAD ANTI MINERALOCORTICOIDE RESULTADOS Sección II RESULTADOS ESPECIFICIDAD ANTI MINERALOCORTICOIDE EFECTOS CRUZADOS CON AR g1 inhibe la actividad transcripcional de AR (50%) g2 No tiene grandes efectos la actividad de AR