Cap 7 From DNA to Proteins: How Cells Read Genome Conocer los mecanismos por los que la celula copia el DNA a RNA ( DE DNA A RNA) Como usa esta informacion para dirigir sintesis e proteina (DE RNA A PROTEINA) Conocer mecanismo de RNA splicing Conocer precursores evolutivos de los sistemas actuales ( RNA y origen de la vida) JA Cardé, PhD Universidad Adventista Alberts et al.

Introducción 1950s - Estructura del DNA es determinada Información hereditaria está en las secuencias de DNA Ya vimos como se pasa sin cambio entre generaciones Como la célula la decodifica? Como dirigen esas instrucciones la formación de organismos como: bacteria, moscas, de humanos? Sabemos que propiedades y funciones de las proteínas se deben a la secuencia lineal de aa

Introducción DNA no dirije la síntesis solo. usa intermediarios ( trabajo en equipo) Una parte de la cadena de DNA se pasa a fragmentos maA cortos de RNAs: r, t y m RNAs mRNA sirve de templado para síntesis de proteínas rRNA provee ambiente para enlaces peptidos tRNA transporta los aa al ribosoma y los ordena

07_01_Genetic info.jpg Dogma Central Conservado Transcripción Traducción RNA splicing Rearreglos 07_01_Genetic info.jpg 07_01_Genetic info.jpg El flujo de la informacion genetica es de DNA a RNA a Proteinas

07_02_Genes express.jpg -Expresión genética Transcripcion y traduccion son los medios por los q la celula lee su info genetica o la expresa, expresa sus genes -Expresión genética 1 gen> varios RNA> varias proteínas Distintos niveles de eficiencias de expresión segun se necesita

Transcripción Sólo porciones se transcriben Produce hebra de RNA complementaria al DNA Polímero de ribonucleótidos unidos por fosfodiester Azucar pentosa ribosa Bases U Hebra sencilla, adquiere estructuras 2rias, partes hebra doble hélice, etc Varios tipos de RNA Señales de inicio y terminación Primer paso al leer uno de los miles de genes es copiar la secuencia de DNA en forma de RNA : transcripcion Es pasar de un lenguaje de nucleotidos a otro de nucleotidos

Diferencias entre DNA y RNA 07_03_RNA _v_DNA.jpg Diferencias entre DNA y RNA 07_03_RNA _v_DNA.jpg Azucar Bases Estructura Localizacion Función Polímero de ribonucleótidos unidos por fosfodiester Azucar pentosa ribosa Bases U Hebra sencilla, adquiere estructuras 2rias, partes hebra doble hélice, etc

07_04_U_A.jpg 07_04_U_A.jpg C con G U con A en lugar de T; 2 enlaces

07_05_RNA.jpg SS RNA - complementaridad intramolecular; Pareos convencionales, no convencionales 07_05_RNA.jpg 07_05_RNA.jpg Estructura DNA DS y RNA SS RNA al ser SS puede doblarse en variedad de forma mas q el DNA como las proteinas 3D Esto le permite llevar a cabo funciones y no solo transportar informacion Hasta actividades cataliticas distinto al DNA Variadas estructuras 2rias

El producto de transcripción es un RNA complementario a una de las cadenas del DNA Cadena codificante- “sense”- tiene la misma secuencia que el mRNA: cuál es? 07_06_Transcription.jpg 07_06_Transcription.jpg Todo el RNA en una celula surge por Transcripcion, parecido a replicacion de DNA Comienza con la separacion de la doble hebra exponiendo las bases de ambas cadenas

07_07_RNApolymer.jpg RNA Polimerasa 07_07_RNApolymer.jpg La enzima que lo fabrica es la RNA polimerasa (DDRP) catalizan la formacion de fosfodiester bonds

RNA Polimerasa Cataliza enlaces fosfodiester Desenreda la hélice 5’> 3’ rNTP Transcripto 1rio se libera inmediatamente Varias copias del mismo gen en poco tiempo

07_08_Transcript_EM.jpg Transcripción en Microscopio Electrónico 1500 ncltds en promedio, 50/sec Transcripción Ribosomal 07_08_Transcript_EM.jpg Tipos de RNA mRNA- codifica para proteínas rRNA-ribosomas, síntesis de proteínas tRNA-adaptadores de AA al mRNA, síntesis de proteínas smRNA-splicing, transporte de proteínas al ER, microRNAs.., 07_08_Transcript_EM.jpg La transcripcion es rapida, la liberacion es casi inmediata

Tabla 7-1: Tipos de RNA producidos en celulas Tipo de RNA Función mRNA Codifica para proteínas rRNA Ribosomas y síntesis de proteínas tRNA miRNA smaRNAs Adaptadores entre mRNA y aa en síntesis de proteína Regulación de expresión genética Splicing, telómeros, etc DIFERENCIAS ENTRE LAS DNA Y RNA POL

07_09_1_bacterial gene.jpg Señales: Start/Stop Promotores (conserv) Punto principal de control 07_09_1_bacterial gene.jpg 07_09_1_bacterial gene.jpg SENALES EN EL DNA DICEN A LA RNA POL DONDE COMENZAR Y TERMINAR

Promotores y terminadores especificos son reconocidos por la RNA pol 07_09_2_bacterial gene.jpg 07_09_2_bacterial gene.jpg En procariotas hay promotores y terminadores que dicen donde comenzar y terminar y son reconocidos por la polimerasa

07_10_transcr_DNA.jpg genes : en cualquier dirección pues hay DS Promotor asimétrico; -10 y -35 Dirección 5‘  3’ 07_10_transcr_DNA.jpg Que asegura que una porción de DNA X sera transcrita? 07_10_transcr_DNA.jpg Siempre se utiliza una hebra como templado

Transcripción Eucariotes: Iniciación Difiere con procariotes en : 3 polimerasas En lugar de un factor de iniciacion( Sigma) se necesitan muchos factores; Factores de transcripcion para formar un complejo Genes a transcribirse no estan cerca uno de otros, facilita el control individualizado por otras secuencias Presencia de nucleosoma, hay q desenredarlo   RNA Eucariote es transcrito y procesado simultáneamente en el núcleo

Factores de Transcripción No. subunidades Peso Molecular de Subunidades Orden/Función TFIIA 3 12,19,35 Estabiliza unión de TBP y TATA (3) TFIIB 1 25 Selecciona sitio de iniciación Recluta la polimerasa II (4) TFIID 12 15-250 Interacciona con factores de (2) regulación TBP 38 Reconoce el “TATA Box” (1) TFIIE 2 34,57 Recluta TFIIH (7) TFIIF 30,74 Une Pol II y TFIIB (6) TFIIH 9 35-98 Desenrrolla el DNA del promotor (8) Pol II 10-220 Cataliza la síntesis de RNA (5) TOTAL 42 ~1,000 Generales GTFs Altamente conservados TATA Box –Binding Protein TFIID Tabla 15-1 Asignada Página 259

Tabla 7-2: Tres Polimerasas de RNA en ecuariotas Tipo de Polimerasa Genes transcritos RNA Pol I Mayoría de los genes para rRNA RNA Pol II Genes estructurales codificantes, miRNA, spliceosoma RNA pol III tRNA 5s rRNA Otros smRNAs, pequeños DIFERENCIAS ENTRE LAS DNA Y RNA POL Ribonucleotidos vs deoxiribonucleotidos

Factores de Transcripción Eu Factores de transcripción generales Se unen al promotor facilitando el inicio TFIID + TBP se une al TATA box TFIIB + RNA Pol Otros TF: IIE, IIH, IIF Complejo de iniciación Cerrado Abierto IIH helicasa y fosforila (kinasa) a RNA pol Se descubre q distinto a procariotas la RNA pol no puede hacer sintesis sola pura

Factores de RNA Pol II - Iniciación Formación del complejo preiniciador TFIID (TBP + TAFs) Se unen al “TATA Box” TFIIA Estabiliza el complejo TFIID-TATA Box Evita la unión de represores TFIIB Se une al TBP y DNA al frente y después del “TATA box” Determina el tamaño o distancia entre el “TATA box” y la secuencia iniciadora.

Factores de RNA Pol II RNA polimerasa II - TFIIF Estabiliza la interacción de la RNA Polimerasa II con el TFIIB y TBP El TFIIF previene que la RNA Polimerasa II se una a lugares no promotores TFIIE y TFIIH Estabiliza el complejo proteína y DNA E es estimulador de H TFIIH Helicasa 5’- 3’ y 3’ - 5’ Adenosina trifosfatasa dependiente de DNA Actividad de cinasa Reparar el DNA Mutado en Xeroderma pigmentosa

RNA polymerase II preinitiation complex El montaje de los GTF en el promotor de eucariotes Copyright 2008 by Saunders/Elsevier. All rights reserved. Fig. 15-7

El montaje del os GTF en el promotor de eucariotes

07_11_pores.nuc.envl.jpg Núcleo: Compartamentalización del proceso Transcripción y procesamiento de los RNAs eucariotas: intranuclear -procariot -transcrip/ Traducción simultáneas -eucariotas Comparta- mentalizados -poros nucleares: transporte de mRNA hacia el citoplasmas 07_11_pores.nuc.envl.jpg 07_11_pores.nuc.envl.jpg RNAs son transcritos y procesados en el nucleo simultaneamente La forma como se manejan los RNA luego de transcripcion es distinta en pro y en euc

Procesamiento de mRNA eucariotas- estabilidad el mRNA 07_12_capping.jpg 07_12_capping.jpg Modificaciones ocurren segun la molecula de mRNA es transcrita Dependen de cual es la funcion del RNA Capping-5-metil-guanosina Poliadenilación- corte y poliAd…

Genes Eucariotas interrumpidos por secuencias No codificantes 07_13_Eucar_v_bact.jpg 07_13_Eucar_v_bact.jpg Organizacion distinta. Los procariotas son promotor y DNA transcriben a mRNA q se usa directo Organización de genes: procariotes vs eucariotes Núcleo: cap y poliA = citoplasma cap y poli A pero…mas cortos..

07_14_exons_introns.jpg Intrones - mas largos Dispersan exones Transcritos no traducidos Hasta 10000 Bacterias? Exones - mas cortos Separados por intrones Transcritos y traducidos 07_14_exons_introns.jpg 07_14_exons_introns.jpg Comparacion entre B globina y Factor VIII – 3 exones vs 26 exones Intrones pueden ser 1 nucleotido a 10000

07_15_end_intron.jpg Splicing: remoción de intrones, empalme de exones Intrones: todos se parecen en algo… 07_15_end_intron.jpg Cortados en lariat entre la “A” y el 5’ del intron Realizado por moleculas de RNA (snRNAs) snRNPs 07_15_end_intron.jpg – Intrones son removidos por Empalme o Splicing El gen completo se comienza a transcribir se le pone capping y segun sigue comienza el splicing Snurps Spliceosome Alternativo

07_16_RNA_chain .jpg 07_16_RNA_chain .jpg Guiado por la secuencia conservada en los extremos del intron se remueve en forma de laso

07_17_spliceosome.jpg Desperdicio? Fuente de cambio Uso eficiente de espacio 07_17_spliceosome.jpg 07_17_spliceosome.jpg Splicing alternativo Anticuerpos en linfocitos B

Empalme Alternativo - Alternative Splicing produce … 07_18_a_tropomyo.jpg 07_18_a_tropomyo.jpg Alfa tropomiosina gen - ejemplo de alternative splicing ……. Anticuerpos Fc – Var -- HiperV

07_19_export_cytop.jpg Exportacion al Nucleo de mRNA “maduros” Una vez maduros o terminados son exportados desde el nucleo

07_20_Pro_v_Eucar.jpg 07_20_Pro_v_Eucar.jpg Aunque replicacion es universal, transcripcion es universal Splicing no PLT Pro y euc manejan de forma distinta sus transcriptos Habilidad de fabricar varias proteinas de un mismo gen viene con un costo hay q botar parte del mRNA q se hace

De RNA a Proteínas Ya sabemos que la información está en el DNA Que ésta es copiada a RNA y luego a proteínas Como se hace la decodificación? La secuencia del mRNA es decodificada en grupos de 3 nucleótidos Para finales de los 50 ya se sabia q la info en el DNA se pasaba a RNA y luego a proteina El debate paso a como se decodificaba la info: Como la informacion en la secuencia lineal de nucleotidos en el RNA se traduce a una secuencia lineal de moleculas quimicamente distintas como los aa en las proteinas?

La secuencia del mRNA se decodifica en grupos de 3 nucleótidos Transcripción es simple de entender por ser nucleótidos y por ser por complementaridad en base a enlaces de H Traducción implica pasar la información a otro lenguaje con símbolos diferentes Porque la traducción no puede ser 1:1? Porque hay 4 letras (nucleótidos) en el mRNA y 20 letras (aa) en las proteínas! Código genético: Reglas por las cuales la secuencia de nucleótidos en un gen se traduce en una proteína via un mRNA Para finales de los 50 ya se sabia q la info en el DNA se pasaba a RNA y luego a proteina El debate paso a como se decodificaba la info: Como la informacion en la secuencia lineal de nucleotidos en el RNA se traduce a una secuencia lineal de moleculas quimicamente distintas como los aa en las proteinas?

64 posibles palabras de 3 letras que usan un máximo de 4 letras 07_21_nucl_sequence .jpg 07_21_nucl_sequence .jpg – Ilustra el codigo descifrado, muestra varios tripletos para el mismo aa 4 letras posibles pero solo 3 a la vez!!!: resulta en un maximo de combinaciones posibles distintas de 4 x 4 x 4 = 4 a la 3 = 64 tripletes posibles, cada tripleto para un aa Solo tengo 20 AA en las proteinas asi que O Algunos tripletos no se usan algunos aa deben ser representados por mas de un tripleto (codigo redundante) Codigo universal en todos los organismos (excepciones en fungi, mitocondria y protozoa)

3 distintos ORFs para leer cada secuencia 07_22_readingframes.jpg 07_22_readingframes.jpg La secuencia en el mRNA se puede leer en 3 distintos marcos de lecuras RF

tRNAs – adaptadores para unir los aa a los codones del mRNA 07_23_tRNA.jpg 07_23_tRNA.jpg El codon en el mRNA no reconoce al aa directamente..

Código Genético Redundante - varios codones diferentes especifican al mismo aa PLT o hay mas de un tRNA para varios aa o algunos tRNA parean con mas de un codón Ambas cosas ocurren algunos aa tienen mas de un tRNA para ellos y : Wobble - algunos tRNAs requieren pareo exacto sólo en los primeras dos bases, toleran disparidad en la tercera base Hay 20 aa para 61 codones del mRNA usando 31 adaptadores tRNAs El número de tRNAs varía en especies (humanos 500 genes de tRNA pero solo para 48 anticodones) Descripcion del Codigo genetico: Redundante o Degenerado: mas de un codon para un aa; dos codones para el mismo aa

07_24_UUU codes.jpg How We Know?: Cracking the Genetic Code

07_25_coding.jpg 07_25_coding.jpg

07_26_2_adaptors.jpg Como se carga cada tRNA? Enzimas específicas acoplan los AA los tRNAs correctos 07_26_2_adaptors.jpg 07_26_2_adaptors.jpg Como cada tRNA adquiere su carga? Aminoacil tRNA sintetasa, 1 por aa Une aa al 3’ del tRNA

Donde se decodifica el código? Ribosomas 07_27_RibosomesEM.jpg 07_27_RibosomesEM.jpg Ribosoma es la maguinaria de sintetizar proteinas: Ribosomas: libres y acoplados al ER

07_28_ribosome.jpg SU peq: parea tRNA al mRNA SU gde: cataliza enlace peptido 07_28_ribosome.jpg Similares en pro y eucariotes – compuestos por proteinas y rRNA y subU gde y sub U peq

Como el ribosoma ejecuta todos los movimientos? 3 lugares 07_29_binding.site.jpg 07_29_binding.site.jpg Cada ribosoma tiene 3 lugares para los tRNA y un lugar para el mRNA A P E

07_30_3_step_cycle.jpg 07_30_3_step_cycle.jpg Sitio A – el tRNA cargado llega al sitio A por pareo entre codon y anticodon

07_31_ribos_shape.jpg 07_31_ribos_shape.jpg El ribosoma es una ribozima: con actividad catalitica

07_32_initiation.jpg 07_32_initiation.jpg Hay codones en el mRNA para START y para STOP en la sintesis de proteinas

07_33_mRNA.encode.jpg 07_33_mRNA.encode.jpg Para detectar el Stard codon en procariota es distinto

07_34_stop codon.jpg 07_34_stop codon.jpg El final del mensaje codificante en ambos es senalado por la presencia de varios stops codons

07_35_polyribosome.jpg 07_35_polyribosome.jpg Proteinas son hechas en poliribosmas mas de un ribosoma en el mismo mensajero

Tabla 7-3 Antibióticos inhiben Síntesis de RNA o Proteínas Efecto Tetra Bloquea unión de aminoacil tRNA al sitio A del ribosoma Strepto Previene transición de iniciación a elongación, causa errores de código Chloramphenicol Bloquea peptidil transferasa en ribosoma Cycloheximida Bloquea translocación en el ribosoma Rifamycin Bloquea iniciación uniéndose a la RNA pol Inhibiddores de las polimerasas procariotas se usan como antibioticos

07_36_proteasome.jpg 07_36_proteasome.jpg Degradacion controlada de las proteinas ayudan a regular niveles de esta en la celula Rutas metabolicas especializadas en degradar proteinas enzimaticamente en sus aa. (proteolisis) – Proteasas Proteosoma - cilindro para proteolisis

07_37_Protein.produc.jpg 07_37_Protein.produc.jpg Varios puntos de control entre el DNA y proteina:

07_38_RNA world.jpg 07_38_RNA world.jpg

07_39_copy_itself.jpg 07_39_copy_itself.jpg

07_40_ribozyme.jpg 07_40_ribozyme.jpg

07_41_catalyze_synt.jpg 07_41_catalyze_synt.jpg

07_42_RNA_DNA.jpg 07_42_RNA_DNA.jpg