Ósmosis y Permeabilidad en el eritrocito Laboratorio de Fisiología para Medicina Karen Acuña Johel Cascante Pedro Rivas Edgardo Soto

OBJETIVOS Determinar la relación entre la forma y el volumen del eritrocito con la tonicidad del medio al que se expone. Observar la relación que existe entre gradientes crecientes de osmolaridad de soluciones salinas y el porcentaje de hemólisis de los eritrocitos mediante el espectofotómetro para determinar la curva de fragilidad osmótica. Comparar la velocidad de hemólisis (s) de los eritrocitos en relación con el grado de permeabilidad de diferentes moléculas en concentraciones isoosmolares con el plasma.

I. Observación de los cambios morfológicos de los eritrocitos Resultados

Observación de los cambios morfológicos de los eritrocitos Figura 1. Dibujo de Eritrocitos al 4% visto desde un microscopio (40X) : a) eritrocito en un medio isotónico, b) eritrocito en un medio hipertónico c) eritrocito en un medio hipotónico. Fuente: Laboratorio de Fisiología, UCR. 2010.

Observación de los cambios morfológicos de los eritrocitos Fuente: Blog de recursos educativos para trabajar contenidos de las ciencias naturales. http://auladenaturales.wordpress.com/page/5/?archives-list=1http://www.youtube.com/watch? v=EA_ss8ZkjAM. Revisada el 18 de marzo de 2011.

ARTICULO Franco R. et al. (2008). Autocrine Signaling Involved in Cell Volume Regulation: The Role of Released Transmitters and Plasma Membrane Receptors. Journal of Cellular Phisiology, Vol 216. Febrero.

Respuesta Regulatoria del Volumen Celular ante Estrés Osmótico Detección del cambio en el volumen por un sensor Transducción de esta señal mediante la activación de cascadas de transducción Ejecución de la respuesta regulatoria

Factores que son sensados Concentración de solutos (<5%) Grosor de la bicapa (extremo) Interacciones macromoleculares dependientes de la forma

Regulación en Estado “Agudo” Pérdida neta de osmolitos intracelulares en respuesta al hinchamiento celular (P.R.V.) Acumulación neta de solutos activos en respuesta a la pérdida de volumen celular (A.R.V.)

ARTICULO Koivusalo, M. Kapus, A. Grinstein, S. (2009). Sensors, Transducers, and Effectors That Regulate Cell Size and Shape. Journal of Biological Chemistry. Vol.284, Marzo.

Incremento Regulatorio del Volumen Ganancia de solutos inorgánicos y orgánicos Gradiente de sodio por la Na/K ATPasa y el potencial eléctrico negativo debido al K

Incremento Regulatorio del Volumen Intercambiadores Na/H Familia NHE (1-2-4) Cotransportadores Na-K-Cl NKCC 1-2 (fosforilados por la reducción en tamaño) Ganancia de solutos orgánicos Taurina-Betaína-Inositol-Sorbitol-Glicerofosfocolina Absorción aumentada del LEC o Biosíntesis Aumentada

Incremento Regulatorio del Volumen Canales de Cationes Inducidos por Hipertonicidad HICC son los mayores responsables en varios tipos de células Paso indiscriminado de cationes alcalinos (entra Na al mismo tiempo que K sale) Canales TRP Se ha visto que pueden también promover entrada de Na y ganancia de volumen

Incremento Regulatorio del Volumen Molécula Señalizadora Función Propuesta PIP2 NHE Kinasas Tyrosin-Kinasas NHE Ser/Thr-Kinasas NHE NKCC Soluto Orgánico Medio de Ingreso Taurina-Inositol-Betaína TauT-SMIT-BGT1 Sorbitol Fosfocolina Síntesis por Glucosa mediante Ald. Retsa. Síntesis por PC mediante Fosfolipasa B Fuente: Koivusalo et al, 2009.

Parte II. Determinación de la curva de fragilidad osmótica Resultados

Figura 2. Porcentaje promedio de hemólisis de una población de eritrocitos de conejo ante diferentes concentraciones de soluciones salinas seriadas. Fuente: Cuadro 1, hoja de recolección de datos, Laboratorio de fisiología para medicina UCR. 10 marzo 2011.

Tipos de cambios Anisoosmóticos Son inducidos por alteraciones en la osmolalidad extracelular Hoffman,E. Lambert, I. Et al. Physiology of cell volume regulation in vertebrates. Physiol Rev. 89. 193-277.2009

Tipos de cambios Isoosmóticos. Cambios isoosmóticos son aquellas alteraciones en el contenido intracelular Hoffman,E. Lambert, I. Et al. Physiology of cell volume regulation in vertebrates. Physiol Rev. 89. 193-277.2009

Sensores Hacinamiento Hoffman,E. Lambert, I. Et al. Physiology of cell volume regulation in vertebrates. Physiol Rev. 89. 193-277.2009

Concentración iónica Hoffman,E. Lambert, I. Et al. Physiology of cell volume regulation in vertebrates. Physiol Rev. 89. 193-277.2009

Modificación de membrana 1 Hoffman,E. Lambert, I. Et al. Physiology of cell volume regulation in vertebrates. Physiol Rev. 89. 193-277.2009

F-Actinina Dominios de unión a ATP, Ca⁺².

Papel de los fosfolípidos. Hoffman,E. Lambert, I. Et al. Physiology of cell volume regulation in vertebrates. Physiol Rev. 89. 193-277.2009

PtdIns(4,5)P2 Hoffman,E. Lambert, I. Et al. Physiology of cell volume regulation in vertebrates. Physiol Rev. 89. 193-277.2009

Modificación de membrana 2 Hoffman,E. Lambert, I. Et al. Physiology of cell volume regulation in vertebrates. Physiol Rev. 89. 193-277.2009

Centro integrador (2008)

Canales para K+ y Cl- (VRACs) Cotransportador electroneutro KCCs Canal para Taurina Koivusalo, M. Kapus, A. Grinstein, S. (2009). Sensors, Transducers, and Effectors That Regulate Cell Size and Shape. Journal of Biological Chemistry. Vol.284, Marzo.

Canal de K+ Gradiente electroquímico Acoplado a salida de Cl- K2P (Ejemplos: TRAAK, TREK-1, TASK), BK, IK, SK, Kv(1.3, 1.5, 4.2, 4.3) Reguladores: Familia de las MAPK (SGK), aa, leucotrieno, Ca2+(μM y ηM), estiramiento de la membrana.

Canales para aniones Corriente de aniones reguladora del volumen (VRACs). VRACs “sensan una reducción en la fuerza iónica intracelular, durante el aumento en el volumen celular”. Cl- principal sustrato, HCO3- Osmolitos orgánicos Reguladores: MAPK (SGK/transcripción), ácidos grasos, Rho GTPase, especies reactivas de oxígeno, Tyrosine-Kinasas y Ca2+.

VRACs Hoffman,E. Lambert, I. Et al. Physiology of cell volume regulation in vertebrates. Physiol Rev. 89. 193-277.2009

Cotransportador KCCs Electroneutro 4 isoformas Regulado por ciclos de serina/treonina fosforilación y desfosforilación Activados por desfosforilación durante el aumento del volumen celular

TRPs Entrada de Ca++ (cationes) Sensores explícitos de cambios en el volumen Teorías sobre la activación: Distención directa de la membrana La movilización de moléculas de anclaje La activación de fosfolipasas La inserción de vesículas del interior de la célula. Al atenuar la función del TRPV 4 y el TRPV 7 se disminuyó la reducción reguladora de volumen en algunas células

Salida de Taurina Flujo modesto 30-90% cuando la célula aumenta de volumen. Se sugiere la participación de los VRACs en el transporte de esta y otros metabolitos orgánicos.

III. Permeabilidad de la membrana para varias moléculas orgánicas en concentraciones isoosmolares Resultados

Figura 3. Tiempo de hemólisis observado durante la aplicación de soluciones isoosmolares con diferentes moléculas a los eritrocitos empacados. Nota: No se observaron tiempos de hemolisis de NaCl y glucosa en el tiempo de laboratorio. Fuente: Cuadro 2, hoja de recolección de datos, Laboratorio de fisiología para medicina UCR. 10 marzo 2011

Factores de moleculares que afectan la difusión El Peso Molecular de la sustancia. Viscosidad Estructura molecular e impedimento estérico de la molécula. Coeficiente de reflexión Carga de la molécula Concentraciones de la sustancia

Factores de membrana que afectan la difusión Presencia de proteínas de membrana específicas para el transporte de solutos y su grado de expresión en las diferentes células. Expresión de canales iónicos de membrana, su grado de expresión y mecanismos de regulación de su función. Velocidad de transporte de las proteínas acarreadoras y probabilidad de apertura de los canales iónicos.

Etanolamina – Etilenglicol - Tiourea Dietanolamina - Butanol - Isobutanol Polaridad y liposolubilidad: La polaridad es mayor en sustancias como el etilenglicol y la etanolamina y más baja en alcoholes como el butanol. A menor polaridad mayor liposolubilidad. Pesos moleculares: Cloruro de Sodio 58,5, Urea 60, Etanolamina 61, Etilenglicol 62, Butanol 74, Isobutanol 74 Tiourea 76, Dietanolamina 105, Glucosa 180. Ramificación de la estructura molecular: El ejemplo más claro el butanol y el isobutanol.

UT-B es codificado por el gene Slc14A1 ubicado en el cromosoma 18 Urea UT-B es codificado por el gene Slc14A1 ubicado en el cromosoma 18 Este transportador es el causante de los bajos tiempos de hemólisis registrados para la urea FUENTE: Serena M. Bagnasco. The Erythrocyte Urea Transporter UT-B. Department of Pathology, Johns Hopkins University School of Medicine, Baltimore, Maryland 20187, USA 2006

Glucosa El GLUT-1 es especialmente importante en tejidos cuyo metabolismo energético depende altamente de la glucosa. Alta afinidad por la glucosa (Km= 1-2mM) El gen del GLUT-1 se ubica en el cromosoma 1p35.31.3 y codifica para una proteína de 492 aminoácidos con un peso molecular de 54,2 kDa 5% del peso total de la membrana del eritrocito. Bermúdez; V et. Al. Biología molecular de los transportadores de glucose: clasificación, estructura y distribución. Sociedad Venezolana de Farmacología Clínica y Terapeútica. 2007.

NaCl Na+ Cl- Cotransportadores NCC, NKCC2, NBC1 KCC, NCC, NKCC2 Intercambiadores NHE , NCX. AE Canales iónicos Na+/K+ ATPasa utiliza la energía del ATP para transportar 3 moléculas de sodio fuera de la célula y a la vez hacer ingresar a ella 2 moléculas de potasio manteniendo una regulación en su volumen.

CONCLUSIONES Los eritrocitos son células que poseen una capacidad limitada de regulación de su volumen. Por eso en un medio altamente hipotónico tienen una gran entrada de agua y sufren un hinchamiento considerable, pudiendo incluso llegar a hemólisis; mientras que en medios hipertónicos experimentan una pérdida de volumen que ocasiona que sufran un proceso de crenación.

CONCLUSIONES Cuando exponemos una muestra de eritrocitos a diferentes medios con concentraciones salinas seriadas podemos ver que el comportamiento no es constante. Podemos apreciar que en los niveles más cercanos a osmolaridades fisiológicas el eritrocito es capaz de manejar los cambios, pero en concentraciones menores extremas los mecanismos se ven superados, y el eritrocito presenta niveles de hemólisis mayores.

CONCLUSIONES Se observa semicuantitativamente que sustancias con características que favorecen la difusión a través de la membrana celular del eritrocito presentan un menor tiempo de hemólisis.

MUCHAS GRACIAS!! PREGUNTAS???

Gráfico de regresión no lineal. Figura 4 .Porcentaje promedio de hemólisis de una población de eritrocitos de conejo al 4%, ante diferentes concentraciones (mOsm/L) de soluciones salinas seriadas. Representación gráfica de los datos estadísticos. Fuente: Cuadro 1, hoja de recolección de datos, Laboratorio de fisiología para medicina UCR. 10 marzo 2011.

REFERENCIAS Barbara E. Goodman. Transport of small molecules across cell membranes:water channels and urea transporters. University of South Dakota School of Medicine, Vermillion, South Dakota 57069.2002   Bermúdez; V et. Al. Biología molecular de los transportadores de glucose: clasificación, estructura y distribución. Sociedad Venezolana de Farmacología Clínica y Terapeútica. 2007. Briceño, L. (2001). Principios de Fluidoterapia: Utilizacion clínica de soluciones parenterales. Segunda edición. Primera reimpresión. San José, C.R. : EDNASSS. Cohen, D. M. (2005). SRC Family Kinases in Cell Volume Regulation. American Journal of Physiology. Vol. 288, Marzo.

REFERENCIAS Franco, R. et al. (2004). Epidermal growth factor receptor is activated by hyposmolarityand is an early signal modulating osmolyte eff pathways in Swiss 3T3 fibroblasts. Cell and molecular physiology, vol. 447, Enero.   H. Pasantes-Morales, et al. (2006). Tyrosine kinases and osmolyte fluxes during hyposmotic swelling. Acta Physiology 2006, Vol 187,Enero. Hoffman,E. Lambert, I. Et al. Physiology of cell volume regulation in vertebrates. Physiol Rev. 89. 193-277.2009 Koivusalo, M. Kapus, A. Grinstein, S. (2009). Sensors, Transducers, and Effectors That Regulate Cell Size and Shape. Journal of Biological Chemistry. Vol.284, Marzo.

REFERENCIAS Lezama, R., Díaz.-Tellez, Ramos G. (2005). Epidermal Growth Factor Receptor is a Common Element in the Signaling Pathways Activated by Cell Volume Changes in Isosmotic, Hyposmotic or Hyperosmotic Conditions. Neurochemical Research, Vol. 30, No. 12, Diciembre.   Michael J. Seatter and Gwyn W. Gould. The Mammalian Facilitative Glucose Transporter (GLUT) Family. Division of Biochemistry and Molecular Biology, Institute of Biomedical and Life Sciences, University of Glasgow, Glasgow G12 8QQ, Scotland. Membrane Transporters as Drug Targets, edited by Amidon and Sadée. Kluwer Academic/Plenum Publishers,New York, 1999. Ross, M. et al. (2006). Histología: Texto y Atlas a color con Biología Celular y Molecular. Editorial Médica Panamericana.

REFERENCIAS Serena M. Bagnasco. Role and regulation of urea transporters. Cell and molecular physiology. Springer-Verlag 2005   Serena M. Bagnasco. The Erythrocyte Urea Transporter UT-B. Department of Pathology, Johns Hopkins University School of Medicine, Baltimore, Maryland 20187, USA 2006. Strange, K (2004). Cellular volume homeostasis. Advanced Physiology Education. Vol 28, Septiembre. W. Liedtke. (2007). TRPV Channels’ Role in Osmotransduction and Mechanotransduction. Springer-Verlag ,Vol. 179, Junio.