Marcaje molecular por sonda. Presenta: Elier soto.

Objetivos de aprendizaje  Explica los procedimientos para el marcaje de fragmentos de DNA utilizando la tecnología de PCR.  Reconoce los tipos y características de sondas moleculares y los fundamentos del marcaje, asi como la importancia de su utilización.  Conoce y explica generalidades de diferentes métodos de marcaje.

Errores mas frecuentes.  La mala traducción de algunos libros de textos, tienden a cambiar la idea general de los conceptos.  Confundir las técnicas de los distintos tipos de marcaje molecular.  No saber de donde proviene el fragmento de Klenow.  Casarse con la idea de que solo existe un solo tipo de marcaje de DNA por sonda

¿Qué es una sonda de DNA?  Son moléculas de DNA de cadena sencilla marcadas mediante radiación o agentes químicos, con el fin de ser utilizadas para la detección de secuencias complementarias de DNA.

Importancia.  La capacidad de encontrar en un genoma las secuencias de DNA de interes mediante sondas especificas siendo usado principalmente en el campo de la medicina.

marcaje de fragmentos de DNA utilizando la tecnología de PCR.  Se usan nucleotidos modificados con moleculas fluorescentes o atomos radiactivos (la molecula fluorescente solo debe de fijarse a la base de uno de los cuatro nucleotidos usados como precursores en la sintesis de DNA)

 Los nucleotidos se marcan radiactivamente con 32P y el 35 S.  Tambien se pueden marcar los nucleotidos con biotina o dixogigenina

marcaje de oligonucleotidos de DNA, para ser Usados en la macarcion de sondas por la la tecnología de PCR.

oligonucleotidos degenerados.

MARCACION DE OLIGONUCLEOTIDOS EN EL EXTREMO 3’  SE MARCAN USANDO LA ENZIMA TERMINAL DEOXINUCLEOTIDO TRANSFERASA (TdT) QUE AGREGA ISOTOPOS RADIACTIVOS DE P-32 EN EL EXTREMO 3’

Marcación de oligonucleotidos con TdT

MARCACION DE OLIGONUCLEOTIDOS EN EL EXTREMO 5’ SE MARCAN USANDO LA ENZIMA POLINUCLEOTIDO CINASA QUE AGREGA UN SOLO FOSTATO DE P-32 EN EL EXTREMO 5’ DE CADA CADENA DE DNA

RNAm cDNA Plantilla para PCR oligonucleotidos Degenarados marcados PCR RT-PCR Sondas DNA marcadas.

SONDAS MOLECULARES CONVENCIONALES. SONDAS. DNA. RNA.

Sondas convencionales, DNA obtenido por clonacion celular. EXTRACCION DEL DNA PLASMIDICO RESTRICCION DEL INSERTO DESNATURALIZACION DEL DNA

Sondas convencionales, RNA obtenido por clonación celular.

Marcaje de sondas Método Directo. Método Indirecto. El marcador se detecta unido a la sonda. El marcador para poderse Detectar debe unirsele una Proteina detectora.

MARCAJE DE SONDAS, METODO INDIRECTO

Generalidades de diferentes tipos de marcaje.  NICK – TRANSLATION.  RANDOM PRIMER EXTENSION.  MARCAJE TERMINAL POR RELLENO.  MARCAJE DE OLIGONUCLEOTIDOS, descrito en marcaje de fragmentos de DNA utilizando PCR, se usa un nucleotido marcado con α– 32P–d NTP, α-35S–d NTP.

Marcación de SONDAS NICK trasnlation.  ACTUAN DOS ENZIMAS: DNasa 1 Y DNApolimerasa 1  SE UTILIZA ADN DOBLE CADENA  SE INTRODUCE LA MELLA AL AZAR MEDIANTE LAS DNAasas.  PUEDEN HACERSE SONDAS NO RADIACTIVAS

NICK TRANSLATION.

Marcación de SONDAS RANDOM PRIMER  SE UTILIZA UNA SECUENCIA DE OLIGONUCLEOTIDOS CONOCIDA.  SE USA ADN SIMPLE CADENA (SE DESNATURALIZA POR CALOR).  SE USA EL FRAGMENTO DE KLENOW PARA GENERAR UNA CADENA COMPLEMENTARIA

Metodo de cebador al azar

Marcaje terminal por relleno

Bibliografia.  Biologia celular y molecular. Lodish, Berk, Zipursky, 4ta. Edicion, editorial panamericana.  Biología molecular e Ingeniería Genética. Luque, José Ángel. ; Editorial Harcourt.