Universidad Nacional Autónoma de México Facultad de Química Curso Genética y Biología Molecular (1630) Licenciatura Químico Farmacéutico Biológico Dra. Herminia Loza Tavera Profesora Titular de Carrera Departamento de Bioquímica Lab 105, Edif E 5622-5280 hlozat@unam.mx

VIII. Regulación de la Expresión genética Objetivo general El alumno identificará los diferentes mecanismos que operan en la regulación de la expresión genética en procariontes y eucariontes

Objetivos particulares VIII. Regulación de la expresión genética El alumno... Conoci-miento Compren-sión Aplica-ción 2. Regulación genética en eucariontes 2.1. Conocerá el papel de la cromatina y de los nucleosomas en la regulación genética. X 2.2. Conocerá las características de los factores de transcripción y su papel en la regulación de la expresión genética. 2.3. Conocerá el papel de las hormonas esteroides en la regulación de la expresión genética. 2.4. Conocerá la importancia del control post-transcripcional de la expresión genética (microRNAs).

Dos genomas muy similares (98% de identidad en su secuencia) La diferencia crucial radica en sus mecanismos de regulación génica

Dos células con el mismo genoma y diferente fenotipo Los mecanismos de regulación génica son los encargados de la diferenciación celular

En eucariontes hay muchos puntos de regulación

Diferentes niveles de regulación genética Regulación transcripcional Regulación post-transcripcional

Regulación traduccional Regulación post-traduccional

Regulación Transcripcional (a nivel de DNA) Componentes fundamentales Secuencias definidas en el DNA (p. ej. región operadora del operón lac en procariotes) (factores en cis) Proteínas reguladoras que reconocen dichas secuencias y se unen a ellas (p. ej. represor del operón lac en procariotes) (factores en trans)

Componentes fundamentales de la regulación transcripcional Promotor: secuencia de nucleótidos necesaria para la fijación de la RNA polimerasa. Secuencias reguladoras: Intensificadoras (enhancers): secuencias que estimulan la transcripción y cuya localización puede ser a miles de nucleótidos de distancia "río arriba o abajo" del promotor Silenciadoras (silencers): secuencias que inhiben la transcripción. También pueden hallarse muy distantes del promotor. Factores basales de transcripción: complejo proteico que interacciona con el sitio promotor. Son esenciales para la transcripción pero no pueden aumentar o disminuir su ritmo. Factores específicos de la transcripción: complejo de proteínas reguladoras que pueden ser activadoras o represoras. Proteínas activadoras: interaccionan con las secuencias intensificadoras del gen. Proteínas represoras: interaccionan con las secuencias silenciadoras del gen.

Secuencias definidas en el DNA Inicio de la transcripción Caja TATA: TATA(A/T)A(A/T) -18 - 25 nts (-1000) *URE (Elementos regulatorios “río arriba”). Son sitios de unión de otras proteínas (factores de transcripción) que facilitan la unión de la RNA polimerasa y la transcripción de ese gen. De 100 a 200 pb del inicio. Enhancers (Secuencias Intensificadoras). Regiones en el DNA que están alejadas por más de 1000 pb del sitio de inicio y que activan al promotor para que ocurra una transcripción más eficiente.

Factores de transcripción (basales y específicos) Activadores Represores Coactivadores Factores de transcripción basal

Los factores de transcripción hacen contacto con la doble hélice mediante: Puentes de hidrógeno Enlaces iónicos Interacciones hidrofóbicas Por si solas, dichas interacciones son débiles, pero el hecho de que sean múltiples hace que el complejo proteína-DNA esté unido muy fuertemente, además de darle específicidad a la unión

Los factores de transcripción reconocen regiones específicas en la doble hélice, determinadas por la secuencia Reconocen patrones de donadores y aceptores de puentes de hidrógeno, y zonas hidrofóbicas, principalmente en el surco mayor Código de reconocimiento

No todos los factores de transcripción reconocen al DNA en su estructura regular Se creía que todo el DNA de una célula tenía una estructura homogénea Nuevos estudios han revelado que existen zonas con “irregularidades” en la estructura del DNA. Muchas de ellas hacen que la doble hélice se doble y dependen de la secuencia (p. ej. AAAANN). Ciertos factores de transcripción reconocen específicamente estas zonas de DNA “curvo”

Factores de Transcripción Además de los factores de transcripción generales que forman el complejo basal de transcripción, hay otras proteínas que se unen con alta afinidad a motivos específicos en los promotores, en los elementos regulatorios y en las regiones intensificadoras. Cremallera (zipper) de leucinas Hélice – vuelta – Hélice Dedos de Zinc Poseen dos actividades Se unen fuertemente al DNA Activan (Activadores) o reprimen (Represores) la transcripción

Estas dos actividades distintas residen en dominios discretos y bien caracterizados de los factores de transcripción Además, pueden tener dominio de dimerización, pues es frecuente que actúen como homodímeros o heterodímeros. Algunos factores de transcripción también tiene un dominio de unión a un ligando, por ejemplo, a una hormona. Dominio de Unión al DNA Dominio de Dimerización Dominio de Transactivación

Dominios de unión al DNA Hélice-Vuelta-Hélice Dominio Hélice-vuelta-Hélice. 4 Hélices alfa. Las hélice 2 y 3 están separadas por un giro  de tal manera que quedan en ángulo recto. Una o dos hélices se unen al surco mayor del DNA Secuencia específica reconocida por la proteína Cro del bacteriofago lambda

Ejemplos de dominios hélice-vuelta-hélice

Los motivos hélice-vuelta-hélice están presentes en factores de transcripción homeóticos Los factores de transcripcion homeóticos regulan la expresión de genes durante el desarrollo embrionario. Estos factores de transcripción se encuentran altamente conservados en eucariontes. La posicion de sus genes en el cromosoma se encuentra en el mismo orden de las regiones del embrión cuyo desarrollo controlan. antenapedia

Factores de transcripción homeóticos Inducción de ojos ectópicos en Drosophila mediante la mutación del factor de transcripción (activador) ey

Dominios de unión al DNA Dedo de Zinc Dominio dedo de Zinc Se forma un asa de 12 aminoácidos que contiene 2 His y 2 Cys. Estos AA coordinan a un ión Zn2+ Esta estructura se repite tres o más veces a lo largo del dominio. Ejemplo: Factor de transcripción Sp1

Dominio de dimerización Zipper de Leucina Zippers de Leucina Contiene una región rica en Leu (cada 7 aa, hay Leu). Se forma una superficie hidrofóbica en una hélice  Esta estructura se forma en las dos subunidades que forman el dímero. Hay interacciones hidrofóbicas entre ellas.

No es posible predecir de manera precisa las secuencias de DNA que reconocerán los distintos factores de transcripción

La expresión genética en eucariontes requiere de cambios en el estado de la cromatina Acetilación Remodelación de la cromatina

Los activadores ayudan a reclutar acetilasas de histona y al complejo de remodelación de la cromatina

Desacetilasas de Histonas (HDACs) (HATs)

Del código genético al código epigenético

Los activadores actúan de manera sinérgica

Mecanismos de acción de los represores

Complejos formados in situ sobre el DNA Cada gen tiene una combinación particular de intensificadores y silenciadores. Genes distintos pueden compartir idénticas secuencias intensificadoras y silenciadoras, pero no existen dos genes que posean la misma combinación de estas secuencias reguladoras.

Estructuras que permiten interacción entre proteínas alejadas

RNA de interferencia: Fenómeno de silenciamiento génico post-trascripcional mediado por un dsRNA con secuencia complementaria a un mRNA específico El Rna de interferencia es un fenómeno que, durante la última década, ha llamado poderosamente la atención de la comunidad científica. Ha alcanzado tal relevancia que le valió el premio Nobel a sus descubridores. Podemos defirnir al RNA de interferencia o RNAi como un fénomeno de silenciamiento génico postranscripcional. Así pues, el RNAi se encarga de interrrumpir el flujo génico en su paso de RNA a proteína.

RNA de interferencia (RNAi)

RNAi RNAi dsRNA dirigido contra un mRNA específico dsRNA-GFP El complejo reconoce a un mRNA específico RNAi Cuando un dsRNA de secuencia específica entra a una célula, es cortado por una exonucleasa llamada DICER en fragmentos de 21 pb´s llamados siRNAs (“RNA´s de interferencia pequeños”), el siRNA se carga en un complejo multiproteíco llamado RISC, el cuál reconoce a un RNAm cuya secuencia sea complementaria a la del siRNA, si hibridan por completo el RNAm es degradado y consecuentemente la proteína para la que codificada no se produce. Entonces, el RNAi es capaz de silenciar genes de manera secuencia específica El mRNA es degradado

RNAi en la célula Diferentes procesos generan RNA de doble cadena

Mecanismo de generación de RNAi

El RNAi tiene diversas aplicaciones Cáncer: silenciamiento de oncogenes, determinación de genes involucrados en la resistencia a fármacos Enfermedades infecciosas: VIH, influenza, herpesvirus, papilomavirus. Estudio de la función de un gen mediante su silenciamiento Silenciar genes de manera específica nos permite responder a un sinfín de preguntas. Por ello al RNAi se le han encontrado y buscado muchas aplicaciones, por ejemplo en investigación y terapía contra el cáncer…… (mencionar ejemplos de la diapo).

Receptores nucleares a hormonas Regulación por hormonas Receptores nucleares a hormonas Receptores a estrógenos, progesterona, testosterona Receptores a glucocorticoides (cortisona, hidrocortisona, dexametasona) Receptores a ácido retinoico, tiroxina y Vitamina D

Superfamilia de receptores nucleares

Receptores nucleares tipo I El receptor unido a una HSP (Heat Shock Protein) se encuentra en el citoplasma Receptores de hormonas sexuales y de glucocorticoides

Receptores nucleares tipo II El receptor se encuentra en el núcleo, unido al DNA y está inactivado por un co-represor Receptores de vitaminas A y D, ácido retinoico y hormona tiroidea

Otros receptores de hormonas están en la membrana plasmática y se requiere de una cascada de señalización para la transcripción de genes

Resumen de los mecanismos de regulación genética en eucariontes Control transcripcional Factores de transcripción Grado de condensación de la cromatina Grado de metilación Control post-transcripcional Splicing alternativo Capping Poliadenilación Control transporte del mRNA Mecanismos que determinan si el mRNA maduro sale o no a citosol Control traduccional Mecanismos que determinan si el mRNA presente en el citosol es o no traducido Control de la degradación del mRNA Mecanismos que determinan la supervivencia del mRNA en el citosol Control de la actividad proteica Mecanismos que determinan la activación o desactivación de una proteína, como así también el tiempo de supervivencia de la misma.