Segmentación - 5 Biol 3019 Biol del Desarrollo JA Cardé, PhD UPR - Aguadilla

Objetivos  Repaso de las etapas principales que caracterizan el proceso de segmentación  Mitosis  blástula  gástrula  Repaso de aspectos comunes en todos los organismos  Detalles en el proceso de segmentación en algunos organismos representativos  C elegans  Xenopus  Drosophila  Glosario Molecular Biology - Glosario Molecular Biology -

Introducción  Polaridad, simetría y el patrón del embrión - características del huevo determinadas antes de la fecundación  El citoplasma tiene rol principal en determinar los patrones de segmentacion, gastrulacion y determinación (celular commitment) antes de la diferenciación  Segmentación  Gastrulación  3 Planos corporales  anterior posterior  dorsal ventral  izquierdo y derecho  Especificados por distintos mecanismos a distintos momentos

Patrones de Desarrollo en metazoas  Organismos clasificados en base a patrones de desarrollo:  Ser eucariota? –  núcleo con cromosomas  mitosis  Ser eucariota multicelular  células surgen por mitosis,  organizadas funcionales como un todo  Ser metazoario?  -  animal,  con desarrollo  PLT gastrula

Patrones de Desarrollo en metazoas  35 filos metazoa  35 tipos de desarrollos  4 ramas principales  Esponjas  Diploblastos  Tripoblastos  Protostomados  Deuterostomados

Patrones de Desarrollo en Metazoas  Esponjas – considerados ancestrales  arqueocitos: totipotentes, pueden diferenciarse en todos los otros tipos de células  Regeneración - celulas dispersadas se pueden reagregar, esto es especie específico  no mesodermo, no sistemas de órganos  pasan gastrulacion, embrion y larva  Muy diferentes a metazoa per tienen:  proteinas reguladoras de genes  casacadas de señales como todos los demas

Patrones de Desarrollo en Metazoas  diploblastos –Cnidaria/Ctenoforos  2 capas germinales  endodermo y ectodermos  Poco o ningún, simetria radial, (raros casos de bilateral, hidra)  Algunos con mesodermo pero no relacionado al mesodermo de triplo  Cindarios con músculos estriado para nadar  molecularmente ni por desarrollo se parecen a los de los superiores

Patrones de Desarrollo en Metazoas  Triploblastos - 3 capas embrionarias  Ecto/endo y mesodermo desarrollado  mucho movimiento  cuerpos grandes  por músculos, sistema circulatorio  Bilaterios: simetría bilateral, con lados izquierdos, subdivididos en:  protostomados  deuterostomados

Patrones de Desarrollo en Metazoas  - protostomados – (boca primero)  se desarrolla primero y cerca del blastoporo  generado en gastrulacion.  ano se forma luego y en otra localizacion  celoma a partir de hueco en el mesodermo (schizocoelus)  Ecdizoarios - muda/exoesqueleto Artrópodos y Nemátodos (redondos)  Lofotrocozoarios – en común:  segmentación espiral  larvas trocóforas (ruedas)  plantónicas  con cilios para locomoción  Gusanos planos, anélidos y moluscos

Patrones de Desarrollo en Metazoas  - deuterostomados – (boca segundo) – la boca se forma luego del ano  Principalmente cordados  Equinodermos  Enterocelomados - celoma formado por bolsas generados en el GI.  Incluye equinodermos y cordados, invertebrados y vertebrado, tienen notocordio  Lancetas, tunicados  Notocordio y arcos branquiales

Patrones de Desarrollo en metazoas  Segmentación  serie de divisiones mitóticas, se segmenta el volumen de citoplasma en blastómeros  velocidad inicial de división celuar y localización de los blastómeros bajo el control de material preformado, mas tarde bajo control del nuevo genoma  No aumento del volumen citoplásmico  Ej:velocidad de 50,000 células en 12 hrs y de 40,000 células en 43 horas  por inhibición temporal de G1 y G2

Fecundacion  Segmentación  fecundación activa síntesis de proteína, de DNA y reinicio del ciclo celular.  Activación del MPF – (mitosis promoting factor) reanuda meiosis en ovocitos y controla segmentación  Mitosis bifásica (M y S), correlaciona con niveles altos y bajos de MPF, respectivamente  MPF compuesto de dos subU: Ciclina B y CDK

Fecundación  Segmentación  - ciclina B – subU grande  conducta ciclica observada (aumenta en M, se degrada en S)  su mRNA es preformado, si se bloquea su traducción  no mitosis  - cycin dependent kinase (CDK) – subU pequeña, regulada por B  activa mitosis fosforilando histonas, proteínas de laminina y subU regladora de miosina  funciones: condensar cromatina, polimerizar membrana, organizar huso mitótico  Ciclo celular temprano es independiente del genoma cigótico

Fecundación  Segmentación  MBT  Mitosis rápidas-bifásicas-sincronizadas  agotan lo preF  MBT – midblastula transition: Se da cuando:  MPF viene a ser regulado negativamente  1) se le añade G1 y G2 al ciclo celular  Xenopus – las añade luego de división 12  Drosophila- añade G2 en la 14 y G1 en el 17.  2) se pierde la sincronía de las divisiones  cada célula produce distintos reguladores de MPF, se van “on their own” (expresión diferencial del genoma)  3) síntesis de mRNA de novo para lo próximo: gastrulación  α Amanitina / Actinomicina D  Cicloheximida / emetina

Mitosis: Mecanismos Citoesqueletales  Perpendiculares entre si  El huso esta interno al anillo.  Cual de ellos genera el zurco de segmentación?  Cual separa cromosomas y transporta?  Localizacion de centriolos define  Orientacion del huso  Plano de la division  orientacion de blastomeros  CarioquinesisCitoquinesis HusoAnillo Contractil Tubulina/Flagelo Citoplasma central Actina/ proceso acros, microvilis Citoplasma cortical Microtubulos (Colchicina/nocoda zole) Microfilamentos (Citocalasina B) -Anterior y posterior – a favor o en contra del reloj - Dorsal y ventral - Izquierda y derecha

Patrones de Segmentación  - Definidos por:  1) cantidad y distribución de vitelo  2) factores en el citoplasma del huevo que influyen en el ángulo del huso y tiempo)  - La cantidad y distribución determina:  donde ocurre la división  el tamaño relativo del blastómero,  vitelo inhibe la segmentación  polo vegetativo – lento sin actividad, mucho vitelo  polo animado – rápido activo, poco vitelo,  el núcleo cigótico se desplaza a este polo

Patrones de Segmentación  Definidos por extremos  Isolecito – poco vitelo. bien distribuido  Segmentación holoblástica  Poco vitelo = larvas voraces  Telo y centrolecitos – mucho vitelo, en áreas concentrado  Segmentación meroblástica: discoidal o superficial  Vitelo para desarrollo completo  Hay genética también: isolecitos q tambien tienen:  holoblástica, variantes: radial, espiral, bilateral y rotacional  Sugiere otros factores (genes)

Gastrulación  Blástula – numerosos blastómeros - - posiciones asignadas por la segmentación  Gástrula – asigna nueva localización a blastomeros, nuevos vecinos, nuevas interacciones entre capas  Plan corporal en multicapas  células que se dispersan en la superficie  ectodermo  células que migran al interior  endodermo y mesodermo

Gastrulación – Movimientos morfogenéticos  Combinación de movimientos que involucran el embrión completo:  invaginación – doblez hacia adentro de una capa de células  involución – movimiento hacia dentro de una capa externa en expansión  esta se desliza sobre la superficie interna de las células externas restantes  ingresión – migración de células individuales e independientes hacia el interior del embrión, se convierten en mesénquima

Gastrulación – Movimientos morfogenéticos  Delaminación – división de una capa de células en 2 o mas capas paralelas,  pareciera ingresión pero resulta en nuevas capas epiteliales  Epibolia – movimiento de capas epiteliales (ectodermo) como una sola unidad para cubrir capas interna, pueden ser por:  células dividiéndose  cambiando de forma  capas intercalándose  o todas a la vez.

Ejes: A/P, D/V, I/D.  El embrión tiene que desarrollar los 3 ejes basales para el cuerpo  AP – antero-posterior – línea desde la cabeza a la cola (boca a ano) (SV en anolis)  DV – dorsal-ventral – línea desde el dorso hasta el vientre.  RL – derecho-izquierdo – linea entre los dos lados del cuerpo.  humanos somos simétricos y asimetricos  pero corazón, hígado, baso, vesícula, apéndice, colon

Caenorhabditis elegans  1mm, vida libre, 959 células, hemafroditas, fecundación interna  Reproducción sexual o asexual  Embriogénesis rápida (16 hrs)  Espermatozoide mótil, ameboide  Linajes celulares bien estudiados: cada célula de donde viene  a que tejido aporta?  Genoma compacto, primer multicelular en secuenciarse  18K – 20K vs 20K – 25K genes pero solo 3% el numero de ncltds

Caenorhabditis elegans  Ovocito rueda por la espermateca  espermatozoides ameboide se funden con ovulo  polispermia evitada por síntesis de quitina  Segmentación holoblástica, rotacional  Cada segmentación es asimétrica  dos células  una celula fundadora (AB,EMS) que se diferencia en otras  celula madre (P1-P4)  descendientes

Eje Antero Posterior  determinado por la posición del pronúcleo del espermatozoide  - el ovocito tiene factores dsitribuidos NO uniformemente (proteinas PAR)  - PAR 3, 6 y PKC-3 en la región cortical uniformemente distribuidas  - PAR 1 y 2 en el centro, PKC3 los fosforila y asi los confina al centro

 Entra esperm  Su centrosoma (centriolos y MTOC) contacta la región cortical  Se generan movimientos que lo empujan al lado del ovulo que se convertirá en posterior  Los microtubulos ensamblados protegen a PAR2 y no es mas fosforilado por lo que migra junto con PAR 1 a la corteza  PAR 1 fosforila a PAR 3 y esto lo obliga a que se aleje de la corteza con la PKC Eje Antero Posterior

 Microtubulos huso contraen a los filamentos de actina/miosina del citosesqueleto  Desplaza a PAR 3, 6 y PKC3 lejos del centrosoma o sea del polo posterior  Luego de la primera división:  PARs 3, 6 y PKC estan en anterior y  PARs 1 y 2 estan en el posterior Eje Antero Posterior

 Se establece luego de la primera división, de la que resultan AB y P1  Cuando AB se divide (ABa/ABp) se agrandan tanto que se comprimen entre si y se deslizan, una queda anterior (ABa) y la otra posterior ABp.  Cuando P1 se divide forma P2 y EMS,  La ABp queda sobre EMS;  PLT…  EMS define ventral y ABp define dorsal Eje Dorso-Ventral

 Se define en etapa de 12 células:  Aqui MS (que sale de EMS,) contacta la mitad de las “nietas” de ABa determinando el lado derecho  Evidencia de rotación en membrana vitelina siempre hacia el mismo lado, antes de division 1  Sugiere lado izq y derecho predeterminados en el cigoto.  Si se mutan las PARs o el cito- esqueleto, la rotación y determinación del lado se da al azar. Eje Lateral; Izq/Der - Asignado

 Temprano, luego de P4 en etapas de 26 células  Hijas de E (Ea y Ep) migran desde lado ventral hacia el centro  Forma blastoporo  Se dividen y forman GI de 20 celulas  Migra P4 por el blastoporo  Hijas de MS migran por lado anterior  Hijas de C y D por lado posterior  6 horas luego hijas de AB para faringe migran  Epibolia de hipoblasto (piel) cierran el blastoporo Gastrulación

 Por 6 horas sigue migración y desarrollo de órganos  Gusano de 556 células  2 líneas germinales  Enfoque celular  diferenciación  Células iguales se diferencian  Apoptosis: 115 celulas  4 mudas  959 células, hemafrodita  Fusión celular – distintivo – sincitios  186  hipodermis  8 sincitios  Vúva, útero y faringe Epilogo