CARACTERIZACIÓN GENÉTICA DE Escherichia coli ENTEROTOXIGÉNICA AISLADA DE BOVINO EN ARGENTINA González Pasayo, R.A.* y Moreira, A.R. Laboratorio de Bacteriología, Sanidad Animal, EEA Balcarce, INTA. La diarrea neonatal de los terneros (DN) es una enfermedad de importancia económica global. E. coli enterotoxigénica (ETEC) es un importante patotipo causante de DN y su patogenicidad involucra la adherencia de la bacteria al intestino delgado mediante factores específicos de adhesión y la producción de una o varias toxinas: enterotoxina termoestable (STa or STb) y/o termolábil (LT) que estimula la secreción de fluidos y electrolitos. Los principales genes de virulencia (GV) de las cepas ETEC bovinas son los que codifican a las adhesina fimbriales K99 y F41, y a la tóxina Sta. El objetivo de este trabajo es comunicar el aislamiento de una cepa F41 + K99 + sta + de un ternero de tambo en Argentina y su caracterización genética en relación a su perfil de genes de virulencia, afiliación filogenética, resistencia a antibióticos y presencia de integrasas clase 1 y 2. La cepa 242 caracterizada fue enviada al Lab. de Bacteriología a través del SDVE. El aislamiento fue obtenido de heces (diagnosticadas E. coli K99 + por inmunoensayo de flujo lateral) de un ternero de tambo Holando Argentino con diarrea de 10 días en Córdoba. La cepa fue identificada por procedimientos bioquímicos standard. Cepas control: ETEC FV10191 (F41 + K99 + sta +, bovina), FV10189 (F18 + LT + sta + stb + porcina) españolas. Extracción de ADN. Por lisis térmica de 10 colonias. Detección de los GV por PCR. Se utilizaron primers específicos para 17 GV de bovinos. Determinación de filogrupos (FG). La filiación de las cepas de E. coli a los GF A, B1, B2, D y E fue determinada por PCR cuádruple descripto por Clermont et al. Detección del gen de la integrasa (intI). Se determinó mediante PCR con cebadores específicos descripto por Orman et al. Secuenciación. Se utilizaron primers específicos para los GV F41, K99 y sta. Las secuencias obtenidas fueron comparadas con secuencias del Genbank con el programa BLAST. Test de resistencia a antibióticos (ATB). Se utilizó el método de difusión Kirby-Bauer con monodiscos según CLSI (2010). Introducción Materiales y Métodos Discusión En este estudio se realizó la primera caracterización genética de una cepa ETEC bovina de Argentina que causó diarrea y muerte. La cepa pertenece al FG A por lo que se asocia con cepas de un núcleo genómico comensal. La presencia de GV plasmídicos como F41, K99 y sta permite inferir la posible adquisición de GV mediante transferencia horizontal por elementos genéticos móviles transformándose en una cepa patógena. El perfil multirresistente no se asocia con la presencia de integrones (el amplicón de 1200 pb obtenido con primers intI1 no fue confirmado por secuenciación) lo cual quizá evidencie el origen reciente de esta cepa y que no ha sido expuesta a una fuerte presión de ATB. La comparación con la cepa FV10191 que presenta un perfil multirresistente mas amplio asociado a la presencia de integrón clase 1 identificado en este estudio, confirma la relación entre presencia de integrones y multirresistencia amplia. Estos resultados aportarán información útil en el tratamiento de la DN y desarrollo de una vacuna local con cepas ETEC. Resultados Bibliografía La cepa E. coli 242 aislada de un ternero de tambo con diarrea fue remitida para ampliar el estudio genético, donde se estudió la presencia de 17 GV. El perfil de GV fue afa8 - bfp - clpG - cnf - eae - EHEChlyA - eltA - f17G - F41 + hlyA - iucD - K99 + papC - sta + stb - stx1 - stx2 -. El genotipo F41 + K99 + sta + corresponde al patotipo ETEC típico que no ha sido descripto antes en nuestro país. Los productos de los 3 genes mencionados fueron confirmados por secuenciación. AMC, amoxicilina + ac. clavulánico; CEC, cefaclor; CL, cefalexina; CNM, cefalonio; COL, cefalotina; ERY, eritromicina; OB, cloxacilina; NA, ác. nalidíxico; RFA; rifampicina; S3, sulfonamidas; TIL, tilmicosin; TMS, trimetroprima + sulfa. intI1*, producto de PCR de 900 pb coincidente con la cepa control E. coli E702 y confirmado por secuenciación. CepaGenes de virulencia FilogrupoIntegrasaResistencia antibiótica F41K99staintl1intl A-- AMC-CL-OB-ERY- RFA-TIL FV A +*- AMC-CEC-CL-CNM- COL- ERY-OB-NA- RFA- S3-TIL-TMS arpA chuA TspE4.C2 yjaA Fig. 1. Perfiles de PCR de los filogrupos (A, B1, B2, C, D, E y F) de E. coli. Cada combinación de los productos de los genes arpA, chuA, yjaA y TspE4.C2 permite la determinación del filogrupo en cada cepa. Calle 1, E. coli ATCC ( /B2, control); calle 2, E. coli K12 ( /A, control); calle 3, muestra 242 ( /A); calle 4, E. coli FV10191 ( /A, control); calle 5, marcador de peso molecular 100 pb.; calle 6, E. coli FV10189 ( /A, control). Tabla 1. Perfil de genes de virulencia, filogrupo, presencia de integrasas y resistencia a antibióticos de la cepa E. coli Clermont, O. et al Environ Microbiol Reports 5:58. -Orman, B.E. et al Antimicrob Agents Chemother. 46: