ESPESTROSCOPIA DE FLUORESCENCIA Y FOSFORESCENCIA. JAIRO DE ANGEL MARTINEZ DEIBER PEDROZO GARIZAO JORGE FONSECA BLANCO

la luz puede ser absorbida y emitida por ciertos compuestos. LUMINISCENCIA En la fosforescencia es mucho mas lento y toma alrededor de 0.001 a 1 segundo en ocurrir. En la fluorescencia el tiempo entre la absorción y emisión de la luz es del orden de 10 −8 segundos.

ESPECTROSCOPIA DE FLUORESCENCIA. Gran sensibilidad Alto nivel alcanzado tanto por los instrumentos requeridos, como por los fluoróforos diseñados para aplicaciones específicas. Fluorescencia: ciertas sustancias absorben energía en forma de radiación electromagnética emitiéndola en una longitud de onda mayor en un período de tiempo muy corto. Se trata de utilizar un haz de luz, por lo general luz ultravioleta, que excita los electrones de las moléculas de ciertos compuestos y provoca que emitan luz de una menor energía.

FLUORÓFOROS. Los fluoróforos se pueden dividir en dos clases generales: extrínsecos e intrínsecos. Dichas moléculas son generalmente orgánicas poliaromáticas o heterociclos. La fluorescencia es el resultado de una serie de procesos que ocurren en ciertas moléculas llamadas fluoróforos.

FUNDAMENTOS. Cuando el fluoróforo absorbe luz uno de sus electrones pasa a un estado excitado (de mayor energía) que es inestable y al retornar a su estado basal, el exceso de energía se libera en forma de luz pero de una longitud de onda mayor (menor energía) a la de excitación. Este proceso es representado por el diagrama de Perrin-Jablonski. Diagrama de Perrin-Jablonski .

ABSORCION EN FLUORÓFOROS. Un fluoróforo absorbe energía electromagnética pasando de un estado electrónico “basal” (S0) a un estado electrónico “excitado” (S1) luego de absorber un fotón (es decir, luz) de energía: E = h .νex. Donde E es la energía, h es la constante de Planck y νex es la frecuencia de excitación. Esta energía es suministrada por una fuente de luz externa. Este proceso está dirigido por distintas reglas de selección y la probabilidad de que la transición se produzca está reflejada por el coeficiente de absortibidad molar, ε (M-1. cm-1) que está determinado por la ley de Lambert y Beer para cada longitud de onda: A = ε . l. c

TEORIA DE LA ESPECTROSCOPIA DE FLUORESCENCIA. Las moléculas tienen diferentes estados llamados niveles de energía se refiere principalmente a estados vibracionales y electrónicos. En general, las especies objeto de examen tendrán un estado electrónico basal (un estado de baja energía) de interés, y un estado electrónico excitado de mayor energía. Dentro de cada uno de estos estados electrónicos hay diferentes estados vibracionales. Primero se excita la muestra mediante la absorción de un fotón de luz, desde su estado electrónico basal a uno de los distintos estados vibracionales del estado electrónico excitado. Las colisiones con otras moléculas causan que la molécula excitada pierda energía vibracional hasta que alcanza el estado vibracional más bajo del estado electrónico excitado. La molécula desciende luego a uno de los distintos niveles de vibración del estado electrónico basal, emitiendo un fotón en el proceso. mediante el análisis de las diferentes frecuencias de luz emitida por espectrometría de fluorescencia, junto con sus intensidades relativas, se puede determinar la estructura de los diferentes niveles de vibración.

TEORIA DE LA ESPECTROSCOPIA DE FLUORESCENCIA. En espectroscopia de fluorescencia se registran espectros de excitación y de emisión. El espectro de excitación corresponde con el espectro de absorbancia. Ambos espectros son una representación de la intensidad de fluorescencia en unidades arbitrarias en función de la longitud de onda en nm. Para registrar el espectro de emisión se fija una longitud de onda de excitación y para el de excitación se fija una longitud de onda de emisión.

Otra característica de los espectros de fluorescencia es que el espectro de emisión es independiente de la longitud de onda de excitación (λexc), debido a la disipación parcial de energía de excitación que ocurre durante la duración del estado excitado. El espectro de emisión de fluorescencia varía marcadamente con la estructura química del fluoróforo y del solvente en el que esta disuelto.

FACTORES QUE AFECTAN LA FLUORESCENCIA. Estructura: La fluorescencia se presenta más comúnmente y en forma más intensa con compuestos que tienen grupos funcionales aromáticos con bajas energías de transición π→π∗. Temperatura y naturaleza del solvente: El efecto de un aumento en la temperatura incrementa el número de choques moleculares, por lo que la desactivación tiende a efectuarse a través de procesos no radiativos y por lo tanto se inhibe la fluorescencia. Efecto del pH: Debido a las diferentes formas químicas que son posibles de existir a diferentes condiciones de pH, la intensidad de fluorescencia también es afectado por este factor. Efecto del oxígeno disuelto: Debido al paramagnetismo de la molécula de oxígeno, esta tiende a desactivar cualesquier estado activado por oxidación fotoquímica de la especie fotoluminiscente, provoca cruzamiento intersistemas y conversiones de las moléculas excitadas al estado triplete

INSTRUMENTOS UTILIZADOS PARA DETECTAR FLUORESCENCIA. Existen distintos tipos de equipos que utilizan los aspectos básicos de la fluorescencia, entre ellos: Espectrofluorómetro y detectores de microplacas: miden el promedio de la fluorescencia de la muestra (el volumen de muestra que mide ronda entre los µL a mL). Microscopio de Fluorescencia: determina la fluorescencia como una función de las coordenadas espaciales en dos o tres dimensiones para objetos microscópicos (por debajo de ~ 0,1 mm de diámetro). Scanner de Fluorescencia: determina la fluorescencia en función de coordenadas en dos dimensiones de objetos macroscópicos como ser geles de electroforesis, blotting y cromatografías. Citometría de Flujo: incorpora un detector de fluorescencia para determinar la fluorescencia de células, en un flujo a través de un capilar. Permite identificar y cuantificar subpoblaciones de células en una muestra compleja. Otros tipos de instrumentos que usan la detección por fluorescencia son los sistemas de electroforesis capilar, de HPLC y los equipos de secuenciación de DNA.

APLICACIONES. Hoy día la fluorescencia es de primordial importancia en la química analítica. Una de sus más espectaculares aplicaciones ha sido en la detección y cuantificación de substancias que son separadas a través del uso de la cromatografía de líquidos. Por otra lado, especies inorgánicas que son difíciles de detectar y cuantificar por espectroscopia UV-Visible o por Absorción Atómica se utilizan por fluorescencia. Adicionalmente a esto los niveles de detección son del orden de partes por billón, cantidades que por otras técnicas son difíciles de detectar.