Métodos rápidos y automatización en microbiología alimentaria Curso optativo “Microbiología de los Alimentos” Alumna: Rocío Albornoz

“Los métodos rápidos y automatizados en microbiología de los alimentos requieren un tiempo reducido para la obtención de los resultados en comparación con los métodos convencionales, son fáciles de usar, precisos y económicamente rentables.”

Sistemas miniaturizados Permiten reducir el volumen de reactivos y medio a emplear en los ensayos. Estudiar en un formato manejable el efecto de un compuesto sobre un gran número de aislados o el de una serie de compuestos sobre un aislado determinado.

Entre los sistemas miniaturizados de identificación microbiana disponibles en la actualidad, basados en el metabolismo de sustratos específicos por parte de los microorganismos y su detección mediante diversos sistemas indicadores, destacan los siguientes: Tarjetas desechables para la identificación sencilla de colonias sospechosas mediante pruebas bioquímicas rápidas (O.B.I.S., Oxoid); Galerías que permiten la identificación de más de 800 especies de bacterias y levaduras (API, bioMérieux); Tubos de plástico con compartimentos que contienen agar con distintos sustratos y con una aguja en su interior que posibilita la inoculación del tubo de forma rápida y sencilla a partir de una única colonia (BBL Enterotube y Oxi/Ferm Tube, BD); Soportes plásticos con pocillos de fácil inoculación que contienen sustratos cromogénicos y/o fluorogénicos en estado deshidratado que se rehidratan en contacto con la muestra (BBL Crystal, BD; RapID systems y MicroID, Remel; Biochemical ID systems, Microgen).

OXOID BIOCHEMICAL IDENTIFICATION SYSTEM (O. B. I. S OXOID BIOCHEMICAL IDENTIFICATION SYSTEM (O.B.I.S.) SALMONELLA Code: ID0570 The Oxoid Biochemical Identification System (O.B.I.S.) Salmonella Test is a rapid colorimetric test for the determination of pyroglutamyl aminopeptidase (PYRase) and nitrophenylalanine deaminase (NPA) activity. Principal of the Test The O.B.I.S. salmonella Test offers a rapid screening method to distinguish Salmonella spp. from those organisms exhibiting similar colonial appearance on common selective Salmonella media. This reduces the need for a full biochemical identification of suspect colonies. Identification of Salmonella relies on primary isolation of the organism on selective enteric media. However there are several other genera among the Enterobacteriaceae also capable of growth on such media and which can have similar colony morphology to salmonellae. The lack of PYRase and NPA activity in Salmonella spp. can be used to differentiate them from Citrobacter spp. Which possess PYRase activity 1,2,3 and Proteus, Morganella and Providencia spp. Which have NPA activity4. Oxoid has developed a new system for PYRase testing 5, using a non-carcinogenic substrate in response to health concerns associated with the use of b -naphthylamide (a potent carcinogen) 6. The PYRase area on the O.B.I.S. salmonella Test Card is impregnated with L-pyroglutamic acid 7-amino-4-methylcoumarin (7AMC) 5. Dimethylaminocinnamaldehyde is used as a colour development reagent. The enzymatic hydrolysis of the substrate produces a purple colour on addition of the O.B.I.S. PYR Developing Solution 5. The NPA area on the O.B.I.S. Salmonella Test Card is impregnated with nitrophenylalanine. Deaminatin of the reagent is shown by an orange-brown colour when the O.B.I.S. NPA Developing Soloution (0.25M sodium hydroxide) is added.

Interpretación de resultados OXOID BIOCHEMICAL IDENTIFICATION SYSTEM (O.B.I.S.) SALMONELLA Code: ID0570 Interpretación de resultados Organism PYRase NPA Salmonella spp. - Citrobacter spp. + Proteus, Morganella and Providencia spp. Reacción PYRase (+):color purpura Reacción NPA(+):color marrón-anaranjado

Posible utilización Agar Verde Brillante Medio muy selectivo. Aislamiento de Salmonella(Colonia típicas de color blanco-rosado opacas, rodeadas de una zona rojo brillante). Algunas cepas de Proteus pueden desarrollar dando colonias semejantes a las de Salmonella.

SISTEMAS MINIATURIZADOS API® Son métodos rápidos Permiten identificar distintos microorganismos a través de la realización de diferentes pruebas bioquímicas; entre ellas podemos destacar las pruebas de fermentación de carbohidratos, la determinación de la producción de H2S y la determinación de la hidrólisis de la gelatina. Consisten en un dispositivo de plástico con varios microtubos que contienen diferentes medios de cultivo deshidratados o diferentes sustratos de enzimas de acuerdo al tipo de prueba que se requiere montar.

API® 20E Permite la identificación de microorganismos pertenecientes al grupo de las enterobacterias y de otros bacilos gram negativos. Es una galería conformada por 20 microtubos. Las cartas de colores correspondientes a las pruebas negativas y positivas tras la incubación son las siguientes:

INOCULACIÓN DE LOS SISTEMAS MINIATURIZADOS Cada microtubo del sistema debe inocularse con una suspensión en solución salina al 0,85% de un cultivo puro del microorganismo a ser identificado. En algunos casos estos microtubos deben llenarse completamente con la suspensión, mientras que en otros se requiere del añadido de parafina líquida estéril, que proporciona las condiciones anaeróbicas necesarias (Instructivo provisto por el Kit). INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS La presencia de enzimas y/o de productos metabólicos generados durante el periodo de incubación reaccionan con los sustratos contenidos en los microtubos y desarrollan en los mismos una coloración que puede aparecer en forma espontánea o con el agregado de algún reactivo para su revelado. La interpretación de los resultados se basa en la observación de las coloraciones desarrolladas, ésta se lleva a cabo mediante la comparación del color obtenido en cada microtubo con el que muestra la carta de colores. De acuerdo a esa interpretación se puede establecer un resultado positivo (+) o negativo (-);finalmente se obtiene un código numérico que permite identificar al microorganismo(API20 código de 7 dígitos).

BBL Enterotube II Es un tubo de plástico constituido por 12 compartimientos, cada uno de los cuales contiene medios de cultivo diferentes, que permiten la determinación de 15 reacciones bioquímicas. Está diseñado para la inoculación simultánea de los 12 medios con una sola colonia, utilizando, la aguja de inoculación dispuesta en el centro.  La combinación de reacciones resultante, junto con la guía de interpretación (libro de códigos), permite la identificación de bacterias pertenecientes a la familia Enterobacteriacea.

Reacciones bioquímicas Prueba Reacción / Enzimas Negativo Positivo Glucose fermentación de glucosa rojo (a naranja) amarillo (a dorado) Gas producción de gas en la fermentación de la glucosa sin desprendimiento de cera Lysine lisina descarboxilasa amarillo morado Ornithine ornitina descarboxilasa H2S producción de H2S de beige a ámbar claro negro Indole producción de indol incoloro rojo o rosa Adonitol producción de adonitol Lactose fermentación/oxidación de lactosa Arabinose fermentación/oxidación de arabinosa Sorbitol fermentación/oxidación de sorbitol VP producción de acetoína (Voges-Proskauer) de incoloro a ámbar claro rojo Dulcitol utilización del dulcitol verde PA fenilalanina descarboxilasa cualquier tono de verde de negro a gris oscuro Urea ureasa de rosa claro a rosa Citrate utilización del citrato azul

En el siguiente diagrama de flujo se muestra cuándo debe utilizarse BBL Enterotube II o BBL Oxi/Ferm Tube II: A partir de un cultivo puro de bacterias Gram negativas podemos discernir mediante la prueba de la oxidasa qué sistema de identificación utilizar.

Para la inoculación de BBL Enterotube II se puede utilizar crecimiento en: Agar MacConkey (MAC) Agar Eosina Azul de Metileno (EMB) Agar Salmonella Shigella (SS) Agar Hektoen Entérico (HE) Agar sangre no selectivos. El cultivo utilizado para la inoculación debe tener por lo menos 18 h, pero generalmente no más de 48 h. Una vez inoculado el tubo debe incubarse 18 – 24 hs. Código de 5 dígitos (manual de códigos).

Métodos Inmunológicos “Los métodos inmunológicos se basan en la reacción específica entre un antígeno y un anticuerpo policlonal o monoclonal.” En microbiología de los alimentos, el método inmunológico más empleado para la detección de microorganismos o sus toxinas es el ensayo ELISA tipo sándwich. En los últimos años, se han desarrollado sistemas que permiten realizar el ensayo de manera automatizada, dirigidos fundamentalmente a la detección de Salmonella, E. coli O157:H7, Listeria monocytogenes, Campylobacter spp. y toxinas estafilocócicas. ELFA es una variante de la tecnología ELISA actualmente utilizada, en ella el producto final de la reacción es fluorescente en lugar de cromogénico.

 Separacion Inmunomagnetica (SIM) Emplea partículas magnéticas recubiertas de anticuerpos específicos para concentrar el antígeno de interés como etapa previa a la realización del ELISA. Permite: Reducir el tiempo requerido para el enriquecimiento de la muestra. Obtener suspensiones que contienen menor cantidad de partículas del alimento, lo que facilita su procesado posterior mediante distintas técnicas (hibridación con sondas génicas, PCR, etc.). Para la separación inmunomagnetica de E.coli 045 de alimentos.

Métodos Genéticos “A diferencia de los métodos citados en las secciones anteriores, que detectan características fenotípicas sujetas de manera natural a variación, los métodos genéticos se dirigen a la detección de características celulares mucho más estables contenidas en los ácidos nucleicos.”

Hibridación de ácidos nucleicos Emplean sondas genéticas (oligonucleótidos sintéticos) marcadas enzimáticamente que, tras hibridar con regiones específicas del ARN ribosómico (una célula bacteriana puede contener hasta 10.000 copias de ARN ribosómico frente a una única copia de ADN cromosómico), catalizan una reacción que da lugar a un producto coloreado a partir de un sustrato cromogénico, lo que es indicativo de la presencia del microorganismo en el alimento.

PCR (reacción en cadena de la polimerasa) Permite amplificar el ADN de los microorganismos diana y disponer de una cantidad suficiente que permita su detección. Se trata de una técnica específica, sensible (en teoría, puede detectar una única copia del ADN diana en el alimento; en la práctica se necesitan unas 103 ufc/ml para una detección reproducible) y rápida.

Agentes intercalantes o sondas específicas con doble marcaje fluorescente además de posibilitar la “visualización” del progreso de la reacción, facilitan la automatización del proceso y permiten la cuantificación de la cantidad de DNA diana presente inicialmente en la muestra (PCR cuantitativo en tiempo real). La técnica de PCR cuantitativo en tiempo real puede emplearse para la detección y cuantificación de: Microorganismos patógenos en los alimentos; (2) Alimentos modificados genéticamente; (3) Fraude por sustitución de especies en productos de elevado valor comercial.

La rapidez en la obtención de resultados es esencial en la industria alimentaria para: Reducir los tiempos de espera en los procesos de producción . Liberar más rápidamente los lotes producidos. Es fundamental en un programa de APPCC exitoso, ya que permite la aplicación de acciones correctoras durante el procesado de los alimentos. “Aunque en la actualidad la mayoría de las técnicas rápidas se dirigen a la detección de bacterias y sus toxinas, es previsible que se desarrollen nuevos métodos para la identificación rápida de virus y parásitos implicados en la transmisión de enfermedades a través de los alimentos. Asimismo, se espera que en el futuro próximo se incremente el uso de los biosensores en la industria alimentaria y de microchips para la detección simultánea de varios patógenos, así como de envases inteligentes que alerten a los consumidores sobre la presencia de microorganismos alterantes o patógenos en los alimentos.”

Muchas Gracias!!!

Bibliografía “Métodos rápidos y automatización en microbiología alimentaria” Publicado por Centro de Vigilancia Sanitaria Veterinaria (VISAVET) el 8 febrero,2008. http://www.madrimasd.org/blogs/alimentacion/2008/02/08/84070 http://depa.fquim.unam.mx/amyd/archivero/IdentificacionConVITEK2_21548.pdf http://www.oxoid.com/uk/blue/prod_detail/prod_detail.asp?pr=ID0570&org=124&c=uk&lang=EN http://virus.usal.es/Web/demo_mr/Enterotube/EnterotubeII.htm Imágenes Google

¿Que enzimas se investigan? OXOID BIOCHEMICAL IDENTIFICATION SYSTEM (O.B.I.S.) SALMONELLA Code: ID0570 Fundamento: Detectar la actividad de dos enzimas a través de un método colorimétrico rápido (lectura inmediata). ¿Que enzimas se investigan? PiroglutamilAminopeptidasa (PYRase) NitroFenilalanina Desamina (NPD) Interpretación: Reacción PYRase (+):color purpura Reacción NPA(+):color marrón-anaranjado

Diferencias generales entre API y Entertotube API (API20) 20 microtubos,20 reacciones bioquímicas. Se utilizan suspensiones de colonias(Escala de Mc farland) para la inoculación de los microtubos. La inoculación no es simultanea. Código de identificación de 7 números. Enterotube 12 compartimentos,15 reacciones bioquímicas. Se utiliza una única colonia para la inoculación. Inoculación simultanea. Código de identificación de 5 números.